Técnicas de obtención de extractos fenólicos

1.6.3.1. Técnicas tradicionales de extracción y análisis

La extracción de compuestos fenólicos es muy compleja y depende de múltiples factores tales como la naturaleza de la matriz que los contiene, o de la estructura química de los compuestos a separar. Por lo tanto, no existe una estrategia concreta a seguir que sea común para todo tipo de muestras, sino que debe optimizarse para cada caso concreto.

En general las técnicas de extracción de compuestos fenólicos pueden agruparse en dos grandes grupos: extracción líquido-líquido, usando disolventes orgánicos y extracción en fase sólida (SPE). En la extracción líquido-líquido, los compuestos fenólicos se extraen por difusión desde la matriz sólida a la fase líquida. En un primer momento, las partículas de los fragmentos sólidos absorben solvente debido a las fuerzas osmóticas, por capilaridad y por solvatación de los iones de las células.

Seguidamente, tiene lugar la difusión de los fenoles desde el interior de las partículas 77

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hacia el exterior (Escribano-Bailón et al., 2003). Por otro lado, la extracción SPE se basa en el uso de cartuchos con un relleno específico que tienen afinidad por los compuestos fenólicos de interés. En este caso, en primer lugar se tienen que activar los cartuchos con tal de potenciar la absorción de los fenoles. Una vez cargada la muestra, se procede a eliminar las impurezas que pudiera contener y, finalmente, se eluyen los compuestos fenólicos usando un solvente que tenga una buena afinidad por ellos y los pueda liberar.

La extracción de los compuestos fenólicos se ve afectada por múltiples factores como:

- Tipo de disolvente: tradicionalmente, el disolvente más usado ha sido el metanol (Obied et al., 2005b). Sin embargo también se han utilizado otros como el etanol, la acetona, el acetato de etilo, el n-butanol, el n-propanol y el isopropanol (Lafka et al., 2011). Hay que tener en cuenta que, en la naturaleza, los compuestos fenólicos, al igual que en el aceite, suelen estar en forma glicosilada.

Esto influye en su extracción haciendo que tengan una mayor afinidad por el agua. De ahí que, en general, en los procedimientos de extracción los solventes orgánicos no se utilizan puros sino mezclados con agua. Sin embargo, para la extracción de formas agliconas de baja polaridad como las isoflavonas y las flavonas es necesario el uso de disolventes orgánicos puros (Bradshaw et al., 2001). En general mezclas hidroalcohólicas del 60-80% permiten una buena extracción de los derivados hidrocinámicos, flavonas, flavonoles y catequinas a partir de muestras de frutas y legumbres (Escribano-Bailon et al., 2003).

- pH del medio de extracción: el pH determina el grado de solubilidad de los fenoles en el solvente de extracción. También puede influir en la extracción de los compuestos que sean potencialmente hidrolizables. En general, la adición de ácido, hasta pH 2 o 3, se suele utilizar para la precipitación de proteínas (Coccon et al, 2001).

- Temperatura de extracción: el uso de elevadas temperaturas mejora la eficiencia de extracción. Esto es debido a q ue las paredes celulares se vuelven más permeables debido a la degradación de los polisacáridos pécticos, incrementándose el coeficiente de difusión y la solubilidad de los compuestos.

También disminuye la viscosidad de los solventes, facilitando el paso de los compuestos fenólicos a t ravés del sustrato sólido. Sin embargo, temperaturas

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excesivas puede provocar una importante degradación de los compuestos fenólicos. Por lo tanto, no es recomendable trabajar a temperaturas superiores a 25-30 °C (Robards, 2003).

- Número de pasos de extracción y volumen del solvente: la eficacia de la extracción se incrementa con el número de pasos en los que se divide el proceso de extracción. Como ejemplo, se obtuvo un mayor rendimientos cuando se realizaron cuatro extracciones usando 50 mL de solvente, que cuando se efectuó una única extracción con 200 mL (Naczk y Shahidi, 2004).

- Forma y el tamaño de partícula: el tamaño de partícula determina la superficie de contacto del soluto con el solvente de extracción. Esto tiene una influencia directa con el rendimiento de extracción, de modo que, al reducir el tamaño se incrementa de forma significativa la extracción de los compuestos fenólicos (Luthria, 2008).

Los métodos tradicionales para la determinación del contenido total de compuestos fenólicosde los extractos obtenidos se basan en técnicas espectrofotométricas, por medición directa de la absorbancia en el ultravioleta o usando métodos colorimétricos como el Folin-Ciocalteau. Sin embargo, la gran diversidad de compuestos fenólicos que existen hace que el grado de selectividad de estas técnicas no sea del todo adecuado, ya que es difícil trabajar a u n a longitud de onda óptima para todos los diferentes compuestos fenólicos. Además, estas técnicas son muy sensibles a interferencias, lo cual puede llevar a una sobreestimación de los resultados (Antolovich et al., 2002). Es por ello que para la correcta identificación y cuantificación de estos compuestos bioactivos, las técnicas cromatográficas unidas a uno a más detectores son las más utilizadas en los laboratorios de análisis, siendo las más sensibles y permitiendo identificar cada uno de los fenoles de forma individual. Por un lado, está la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y por el otro, la cromatografía de gases (GC). Ambas técnicas ofrecen buenos resultados. Sin embargo, la necesidad de derivatizar en la GC hace que su uso se vea limitado a los analitos en los que esto es posible.

1.6.3.2. Nuevas tendencias en las técnicas de extracción

Los métodos tradicionales de obtención de extractos fenólicos usando disolventes orgánicos presentan numerosos inconvenientes. En general, se trata de métodos muy largos y laboriosos que consumen una gran cantidad de solvente y cuya selectividad

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depende considerablemente de los compuestos fenólicos presentes en la materia prima.

Además, se debe tomar en consideración que para la utilización de los extractos en la industria alimentaria es conveniente evitar en la medida de lo posible el uso de disolventes orgánicos, sobre todo de aquellos que puedan presentar algún tipo de toxicidad (King, 2000). Por todo ello, en la actualidad, se están desarrollando nuevos

sistemas de extracción que pretenden solucionar estos problemas. Los más destacados son:

- Extracción supercrítica: la extracción supercrítica se basa en el uso de un fluido en condiciones de presión y temperatura por encima de su punto crítico. Bajo estas condiciones, las propiedades del fluido cambian y se sitúan entre las de un gas y un líquido. Así, mientras que su densidad es más parecida a la del líquido, la viscosidad se parece más a la del estado gas y la difusividad presenta valores intermedios entre los dos estados. En general, se considera que el estado supercrítico es aquel en el que el líquido es compresible (Herrero et al., 2006).

Debido a las particulares propiedades físico-químicas de los fluidos supercríticos, su uso presenta ciertas ventajas respecto a l os métodos tradicionales de extracción. De esta manera los rendimientos de extracción son mayores que si se usara en estado líquido, en parte, debido al alto valor del coeficiente de difusividad. Entre los solventes usados en forma supercrítica el más usado es el dióxido de carbono, debido a la mayor facilidad que hay para alcanzar su punto crítico (31,3 °C y 72,9 atm). Además, el hecho de que el dióxido de carbono sea gas a t emperatura ambiente permite la obtención de extractos libres de residuos. Esta técnica es una de las que más auge ha tenido, usando para extraer compuestos fenólicos de diferentes fuentes como legumbres, especias, plantas aromáticas y frutas (Herrero et al., 2010).

- Extracción con microondas: en la última década han aumentado considerablemente el número de estudios basados en la aplicación de microondas para acelerar la extracción de analitos de diferentes matrices. Las microondas son radiaciones no ionizantes que se caracterizan por producir cambios en la vibración de las moléculas por migración de los iones y rotación de los dipolos sin por ello cambiar su estructura molecular. Esta técnica es muy útil para la extracción de compuestos fenólicos que sean estables térmicamente a partir de muestras sólidas usando para ello mezclas de disolventes polares y no

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polares (Mahugo et al., 2009). Con el fin de optimizar el rendimiento de extracción usando esta tecnología se han estudiado diferentes parámetros del proceso como la temperatura, la potencia, el tiempo de extracción, el volumen de solventes y diferentes mezclas de disolventes como acetona-hexano y acetona-metanol. Entre estos parámetros los que han mostrado un mayor impacto son la temperatura y la potencia de trabajo.

- Extracción acelerada con disolventes: esta técnica de extracción consiste en el uso de una celda que contiene la muestra sólida y a la que se introduce el disolvente a elevada presión y temperatura con lo que se favorece la difusión de los compuestos fenólicos en un corto periodo de tiempo y con gran eficiencia.

En este caso, a d iferencia de la extracción con fluidos supercríticos, las condiciones son inferiores a las del punto crítico. Así, las presiones que se pueden llegar a alcanzar en el interior de las celdas son del orden de las 210 atm y 200 °C (Ramos et al., 2002). La extracción se puede hacer de forma estática (dejando la muestra con el solvente dentro de la celda presurizada durante un periodo de tiempo), dinámica (haciendo pasar el fluido presurizado por la celda continuamente) o estático-dinámica (combinando ambas modalidades) (Japón-Lujan y Luque de Castro, 2007).

- Extracción con agua s ub-crítica: las condiciones externas necesarias para alcanzar el punto crítico del agua (374 °C y 218 atm) hacen que no sea factible su uso en condiciones supercríticas con fines extractivos (Li et al., 1993). En cambio, debido a las particulares propiedades de agua, es especialmente indicada para usar en condiciones sub-críticas (es decir, a elevada presión y temperatura pero situándose por debajo del punto crítico con lo que siempre se mantiene en su estado líquido). Así, debido a los cambios que sufre en los valores de la constante dieléctrica, la tensión superficial y la viscosidad hacen que aumente la difusión de los compuestos fenólicos en ella con el que se obtienen grandes rendimientos de extracción. Esta técnica ha sido usado para extraer compuestos fenólicos de plantas aromáticas como el romero y la menta y para la extracción de aceites esenciales (Ozel et al., 2003).

- Extracción asistida acústicamente: Actualmente, los ultrasonidos de potencia se han afianzado como alternativa viable en el proceso de extracción de compuestos fenólicos a partir de una amplia variedad tanto de productos como

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Introducción de subproductos agroalimentarios. Dado que esta fue la técnica elegida para la extracción de componentes bioactivos a p artir de los subproductos generados durante el proceso de elaboración del aceite de oliva, a continuación se exponen los fundamentos y las principales aplicaciones de esta nueva tecnología en el ámbito agraolimentario.