The Stakeholders

A quebra de dupla fita do DNA é um dos danos mais perigosos ao DNA, podendo ser originada através de radiação ionizante, determinadas drogas quimioterápicas, espécies reativas de oxigênio e estresses mecânicos sobre os cromossomos. O estresse oxidativo, em particular, pode resultar em dano aos componentes celulares como proteínas, lipídios e principalmente o DNA, levando à mutagênese e possível morte celular (COOKE et al, 2003; MIRANDA- VILELA et al, 2010). Nesse sentido, o rearranjo errôneo da DSB do DNA pode ocorrer, levando à perda ou amplificação do material cromossômico, translocações e por fim, à tumorigênese (KHANNA e JACKSON, 2001). Esta quebra ainda constitui um problema particular para o controle de qualidade da informação genética porque ambas as fitas são afetadas e uma não serve como modelo para a outra (HAKEM, 2008; KANAAR, WYMAN e ROTHSTEIN, 2008).

Existem duas principais vias para o reparo da recombinacional: a recombinação homóloga (HR) e a junção de extremidades não homólogas (NHEJ), as quais são livre de erro e propensa a erro, respectivamente. Nos mamíferos a via NHEJ é predominante e a escolha entre as duas vias também depende da fase do ciclo celular, onde a HR ocorre principalmente na fase S e G2 e a NHEJ na fase G0/G1 (JACKSON, 2002; HELLEDAY, 2003; CHRISTMANN et al, 2003). Na HR há a preservação do material genético, uma vez que o molde doador de sequências de DNA é usualmente uma cromátide irmã (Figura 2). A NHEJ, por sua vez, pode ser acompanhada por ganha ou perda de nucleotídeos nas junções (Figura 3) (MIMITOU e SYMINGTON, 2011).

Figura 2. Mecanismo da Recombinação Homóloga (Christmann et al, 2003)

Na via HR, uma molécula de DNA não danificada é usada como fita molde para o reparo. A HR é iniciada por uma ressecção do nucleotídeo da DSB pelo complexo MRE11- Rad50-NBS1. A Rad52 então compete com o complexo Ku pela ligação às pontas terminais do DNA o que determina se a DSB será reparada via HR ou NHEJ. A Rad52 interage com a Rad51 que forma nucleofilamentos, liga DNA de fita única e de fita dupla e promove interações com uma região homóloga em uma molécula de DNA não danificada. Na montagem da nucleoproteína da Rad51 participam cinco diferentes parálogos da Rad51: Rad51B, C e D, XRCC2 e XRCC3. Por fim, as estruturas resultantes são reconstituídas através de junções Holliday (CHRISTMANN et al, 2003).

Ainda de acordo com Christmann et al (2003), pela via NHEJ as duas pontas terminais de uma DSB são ligadas sem a necessidade de homologia de sequências. Inicialmente ocorre a ligação de um complexo formado por proteínas Ku70 e Ku80 ao DNA danificado, logo após, o heterodímero Ku se associa com a subunidade catalítica de DNA-PK (XRCC7), formando uma haloenzima DNA-PK ativa. A DNA-PK interage com o XRCC4, que forma um complexo estável com a DNA ligase IV. Este complexo então se liga às pontas terminais da molécula de DNA e une as moléculas de DNA com pontas terminais complementares. Uma vez que o DNA é reparado, as células saem da fase de checagem e prosseguem com o ciclo celular. Entretanto, Figura 3. Mecanismo da Junção Terminal Não Homóloga (NHEJ) (Christmann et al, 2003)

se o dano não for reparado, a célula é direcionada para a apoptose através do p53 (HAKEM, 2008).

Recentemente, vários estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de correlacionar alguns polimorfismos do grupo de genes de reparo do DNA associados às DSBs com diferentes tumores, como: carcinoma colorretal (KRUPA et al, 2011), leucemia mielóide aguda (HAMDY et al, 2011; LIU et al, 2011), câncer de mama (WANG et al, 2010; GAO et al, 2011; SUN et al, 2011), câncer endometrial (KRUPA et al, 2011) e em carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (LU et al, 2007; WERBROUCK et al, 2008; WERBROUCK et al, 2009; SLIWINSKI et al, 2010; PRATESI et al, 2011).

O XRCC3 (X-ray repair cross-complementing group 3), localizado no locus 14q32.3, é um dos genes pertencentes à família do reparo de DNA por HR, estando relacionado com a manutenção da estabilidade cromossômica. Seu polimorfismo mais frequente é a transição C→T que ocasiona a substituição do aminoácido Thr para Met no códon 241. Este polimorfismo exibe baixa penetrância e papel importante no desenvolvimento de algumas neoplasias malignas (QIU et al, 2010). Os polimorfismos genéticos em genes de reparo de recombinação homóloga, como o XRCC3, podem causar haploinsuficiência proteica (ALSBEIH et al, 2010) e são geralmente associados com um aumento no risco de desenvolvimento do câncer (SMILENOV, 2006; KRUPA et al, 2011; ROMANOWICZ- MAKOWSKA et al, 2011).

Diversos estudos têm avaliado os SNPs do XRCC3 em diferentes neoplasias malignas: câncer de mama (DUFLOTH et al, 2008; ROMANOWICZ-MAKOWSKA et al, 2011), câncer de pulmão (POPANDA et al, 2004; LÓPEZ-CIMA et al, 2007), câncer colorretal (KRUPA et al, 2011), carcinomas de cabeça e pescoço (WERBROUCK et al, 2008; SLIWINSKI et al, 2010) e carcinomas orais de células escamosas (KIETTHUBTHEW et al, 2006; YEN et al, 2008; WERBROUCK et al, 2009).

Kietthubthew et al (2006) investigaram a associação entre COCEs e vários polimorfismos em genes de reparo de DNA, incluindo o XRCC3 Thr241Met (grupo caso = 106, grupo controle = 164). Os autores observaram a existência de um risco aumentado para tais neoplasias e a ocorrência do polimorfismo supracitado (p=0,01). Adicionalmente, observou-se um risco maior quando este polimorfismo foi combinado com outros (XRCC1 194Trp, XPD éxon 6; p<0,01). Estes achados sugerem a existência de interações entre determinados genótipos que tornariam o indivíduo mais susceptível ao desenvolvimento do COCE. Um risco

ainda maior foi encontrado nos pacientes portadores do alelo polimórfico para o XRCC3 241Met e XRCC1 194Trp associado à ingestão de bebidas alcoólicas e ao fumo (p<0,01 e p=0,06, respectivamente), indicando que os polimorfismos pesquisados podem modificar a susceptibilidade individual para determinados carcinógenos ambientais.

Werbrouck et al (2008), por sua vez, avaliaram a associação entre diversos polimorfismos em genes de reparo de DNA, incluindo o XRCC3 e o Rad51, e o risco de desenvolvimento de carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço (grupo caso = 152, grupo controle = 157). Observou-se uma associação significativa entre o polimorfismo XRCC3 c.722 e o risco para os carcinomas supracitados (p=0,02). A variante c.-3429 do Rad51 exibiu um efeito protetor, estando relacionada principalmente ao câncer na cavidade oral onde houve uma diminuição considerável do risco (p=0,05). Este polimorfismo encontra-se situado na região 5’-UTR do gene Rad51, sendo relacionado com a regulação da transcrição, translação e estabilidade do RNAm. De acordo com esses resultados, os autores sugerem que o produto do gene Rad51 polimórfico pode provocar alterações nessas funções anteriormente descritas.

Werbrouck et al (2009) analisaram a relação entre polimorfismos de alguns genes de reparo de DSBs (XRCC3, Rad51, Lig4, Ku70 e Ku80) e a ocorrência de reações agudas após radioterapia de intensidade modulada em 86 pacientes com carcinomas de cabeça e pescoço. Eles verificaram o grau de mucosite, dermatite e disfagia destes pacientes. Observou-se associação entre os genótipos XRCC3c-722CT/TT e Ku70c-1310CG/GG e o desenvolvimento de disfagia severa (p=0,033 e p=0,014). Os autores relatam ainda que a capacidade de prever a susceptibilidade dos pacientes a reações teciduais normais poderia melhorar a eficácia da radioterapia. Para tanto, é de grande importância identificar os perfis genéticos associados com um risco aumentado ou reduzido de complicações pela radioterapia.

Sliwinski et al (2010) investigaram a associação entre o risco do desenvolvimento de carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço e o polimorfismo nos genes XRCC3 (Thr241Met) e Rad51 (G135C). A amostra foi composta por 97 pacientes com lesões hiperplásicas pré-cancerígenas da laringe, 191 com carcinomas de células escamosas da cabeça e pescoço e 353 pacientes saudáveis. Os genótipos GT e TT do XRCC3 e o GC do Rad51 foram relacionados com um aumento no risco para as lesões hiperplásicas pré-cancerígenas e o carcinoma de células escamosas (p<0,0001). Também se evidenciou ausência de correlação linear entre as variantes polimórficas do XRCC3 e as do Rad51 (exceto 135CC), o tempo de duração ou intensidade do hábito de fumar e ingerir bebidas alcoólicas e o risco para as mesmas

lesões (p>0,05). Os autores ainda sugerem que esses SNPs podem ser considerados como marcadores de diagnóstico precoce para a ocorrência de câncer de cabeça e pescoço.

Pratesi et al (2011) investigaram a associação entre a ocorrência de reações agudas após a radioterapia e alguns polimorfismos genéticos (XRCC1 c.1196A > G, XRCC3 c.722C > T, Rad51 c.-3429G > C, Rad51 c.-3392G > T, e GSTP1 c.313A > G) em 101 pacientes com carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço. O polimorfismo XRCC1-399Gln foi associado com uma maior frequência de mucosite (p=0,011), os genótipos Rad51 c.-3429 CC/GC com a ocorrência de disfagia (p=0,031) e os polimorfismos XRCC1 p.Gln399Arg /Rad51 c.-3429 G > C, isolados ou juntos, com a ocorrência de toxicidades agudas (p=0,001). Os autores não observaram correlação entre o polimorfismo XRCC3 p.Thr241Met e reações agudas (p>0,05). Nesse sentido, os mesmos enfatizam que os dados existentes sobre a associação destas reações e os SNPs ainda são controversos.

Kostrzewska-Poczekaj et al (2013) avaliaram a associação entre polimorfismos nos genes XPD (Lys751Gln), XRCC1 (Arg300Glu) e XRCC3 (Thr241Met) com o risco de desenvolvimento de câncer de cabeça e pescoço em adultos jovens (<45 anos). Foram examinados 90 jovens com câncer de cabeça e pescoço, 160 jovens saudáveis e 205 idosos com câncer de cabeça e pescoço (>45 anos). O grupo de jovens com câncer exibiu uma frequência significativamente maior das variantes XRCC1 Glu/Glu e XRCC3 Thr/Met em comparação aos jovens saudáveis (p=0,0116 e p=0,0386, respectivamente). O XPD não revelou dados significativos (p>0,05). Os autores especulam que polimorfismos nos genes XRCC1 e XRCC3 podem contribuir como fator de risco para o câncer de cabeça e pescoço, interagindo com alguns agentes ambientais, como o fumo de tabaco.

3 PROPOSIÇÃO

O DNA humano está constantemente exposto a diversos agentes tóxicos, podendo induzir a ação de mais de 150 genes de reparo, muitos dos quais reduzem as mutações e mantêm a estabilidade genômica. Polimorfismos em vários destes genes têm sido identificados e associados com diferentes carcinomas de diversas partes do corpo, porém são poucos os estudos realizados em COCE. Além disto, há discrepâncias quanto aos resultados, principalmente em relação a diferenças étnicas das populações estudadas e ao pequeno tamanho das amostras. Diante do exposto, o objetivo desta pesquisa consistiu em detectar a frequência de polimorfismos nos genes de reparo de DNA XPD e XRCC3 (especificamente as regiões Lys751Gln e Thr241Met, respectivamente) em uma série de casos de COCE em material parafinado através da técnica PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição). Esses polimorfismos foram correlacionados às características clinicopatológicas dos pacientes, como: idade, sexo, presença ou não de metástase e gradação histológica de malignidade de Bryne, com a finalidade de verificar se os polimorfismos estudados poderiam estar relacionados com o comportamento clínico e biológico destas neoplasias.