Regulation of Control and Monitoring System

Como citado anteriormente, este estudo utilizou amostras estocadas de DNA genômico previamente extraído de casos de carcinoma oral de células escamosas e hiperplasias fibrosas inflamatórias. O DNA proveniente de blocos de parafina foi extraído através da otimização de dois protocolos diferentes: utilizando-se a resina Chelex100® (BioRad, Hercules, CA, USA) e o QIAamp DNA minikit® (QIAGEN, Hamburg, Germany). Com o intuito de se evitar contaminação, as amostras foram manipuladas em capela de fluxo laminar com a utilização de equipamentos de proteção individual. Para a realização da desparafinização utilizou-se o solvente orgânico xilol e para a digestão

metodologia foi otimizada por Nascimento (2010).

A extração de DNA através do uso da resina Chelex100® foi dividida nas etapas de desparafinização, digestão e purificação. Durante a desparafinização, 25 mg de tecido parafinado (aproximadamente 6 cortes de 10 μm) foram colocadas em tubos para microcentrífuga, sendo adicionados 1.200 μl de xilol e o material foi vortexado. Os tubos foram então incubados em banho-maria a 65°C durante 30 minutos. Após esse período foi realizada uma centrifugação a 14.000 rpm durante cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O sobrenadante foi então removido por pipetagem sem a remoção do pellet. Foram novamente adicionados 1.200 μl de xilol, o material foi vortexado e depois os tubos foram incubados em banho-maria a 65°C por 30 minutos. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente (25°C) e o sobrenadante foi removido por pipetagem sem remoção do pellet. Foram adicionados 1.200 μl de etanol a 100% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Foram adicionados novamente 1.200 μl de etanol a 100% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Foram adicionados 1.200 μl de etanol a 70% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Foram adicionados 1.200 μl de água εilli-Q® autoclavada ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet.

Após estes procedimentos, procedeu-se à etapa de digestão enzimática. Para tanto, foram adicionados à mistura 600 μl de Chelex100® a 20%, 20 μl de proteinase K a 20 mg/ml e 42 μl de Dithiothreitol a 60 mg/ml. O material foi incubado em banho-maria a 56°C até a lise tecidual completa. Até que a lise fosse obtida, foram adicionados 10 μl de proteinase K a 20 mg/ml por dia e os tubos foram vortexados.

Na etapa de purificação, os tubos foram incubados a 99°C por 10 minutos em banho-maria e depois centrifugados a 14.000 rpm (25°C) por cinco minutos. O

ml de Chelex100® a 20%. O material foi novamente centrifugado a 14.000 rpm (25°C) por cinco minutos. O sobrenadante foi colocado em tubos para micro-centrífuga de 1,5 ml e foi adicionado 1 ml de Chelex100® a 20%. Por fim, os tubos foram acondicionados em freezer a -20°C.

A extração de DNA através do uso do QIAamp DNA minikit® também foi dividida nas etapas de desparafinização, digestão e purificação. Durante a desparafinização, 25 mg de tecido parafinado (aproximadamente 6 cortes de 10 μm) foram colocadas em tubos para microcentrífuga, sendo adicionados 1.200 μl de xilol e o material foi vortexado. Os tubos foram então incubados em banho-maria a 65°C durante 30 minutos. Após esse período foi realizada uma centrifugação a 14.000 rpm durante cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O sobrenadante foi então removido por pipetagem sem a remoção do pellet. Foram novamente adicionados 1.200 μl de xilol, o material foi vortexado e depois os tubos foram incubados em banho-maria a 65°C por 30 minutos. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente (25°C) e o sobrenadante foi removido por pipetagem sem remoção do pellet. Foram adicionados 1.200 μl de etanol a 100% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Foram adicionados novamente 1.200 μl de etanol a 100% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Foram adicionados 1.200 μl de etanol a 70% ao pellet e o material foi vortexado. Procedeu-se à centrifugação a 14.000 rpm por cinco minutos em temperatura ambiente (25°C). O etanol foi então removido por pipetagem, sem a remoção do pellet. Os tubos foram então incubados para micro- centrífuga a 37°C até que o etanol evaporasse (10 a 15 minutos aproximadamente). O pellet tecidual foi então ressuspendido em 180 μl de Buffer ATL (SDS 2,5-10%).

Após estes procedimentos, procedeu-se à etapa de digestão enzimática. Para tanto, foram adicionados à mistura 20 µl de proteinase K a 20mg/ml, os tubos foram vortexados e incubados em banho-maria a 56°C. Até que a lise tecidual fosse obtida, foram adicionados 10 μl de proteinase K a 20 mg/ml por dia e os tubos foram vortexados.

guanidínio a 25-50%), os tubos foram vortexados por 15 segundos e incubados a 70°C por 10 minutos. Foram então adicionados 200 µl de etanol (100%) na amostra, os tubos foram vortexados por 15 segundos e incubados a 70°C por 10 minutos. Posteriormente, a mistura foi colocada para a coluna do QIAamp DNA minikit® e centrifugada a 8.000 rpm por um minuto. Depois a coluna foi colocada em outro tubo coletor e houve o descarte do tubo contendo o filtrado. Foram adicionados nos tubos 500 µl de Buffer AW1 (cloreto de guanidínio a 50-100%) e o material foi centrifugado a 8.000 rpm por um minuto. Novamente a coluna foi colocada em outro tubo coletor e houve o descarte do tubo contendo o filtrado. Foram adicionados 500 µl de Buffer AW2 (etanol a 70%) e o material foi centrifugado a 8.000 rpm por um minuto. A coluna foi então colocada em outro tubo de dois ml, centrifugada por um minuto a 14.000 rpm e o tubo coletor foi descartado. A coluna foi depois transferida para um tubo para micro-centrífuga de 1,5 ml e o tubo coletor contendo o filtrado foi descartado. Foram adicionados 200 µl de Buffer AE (10 mM Tris-Cl, 0.5 mM EDTA pH 9.0) ou água destilada, a mistura permaneceu em temperatura ambiente (25°C) por um minuto e depois centrifugada a 14.000 rpm também por um minuto. Por fim, os tubos foram acondicionados em freezer a -20°C.