Dois pontos críticos ou limitantes no sequenciamento pela técnica de Sanger podem ser ressaltados. Quando se tratar de mutações somáticas, é necessário que 20% dos alelos mutantes se façam presentes na amostra do tumor para que sejam, então, detectados (SHUANGSHOTI, 2011). Está técnica é efetivamente afetada por contaminantes, presença de estruturas secundárias na sequência alvo. Portanto, a pureza e integridade do DNA representa características fundamentais quando se trata de obter sequências possíveis de leitura e interpretação e, alguns cuidados visando essas propriedades das sequências devem ser desenvolvidos em fases precoces da extração ou anterior a mesma. Como de praxe nestes estudos, os produtos de PCR foram sequenciadas bidirecionalmente (direto e reverso), pelo método de Sanger, para garantir uma melhor qualidade na caracterização dos nucleotídeos.
Os dados gerados pela leitura do sequenciador automático é uma demonstração gráfica da sequência (veja a figura 9). Esses eletroferogramas tiveram suas sequências nucleotídicas visualizadas e analisadas utilizando-se do software Sequence Scaner v1.0.
É fato que vários autores também demonstraram experimentalmente que a perda de
Figura 9: Eletroferograma parcial de uma sequência reversa de DNAdo exon 1 do KRAS. Neste trecho do podem ser observados os picos de alelos obtidos pelo primer R e o comprimento do trecho do amplicom que foi analizado, pela sequência de nucleotídeos sombreado de verde, da amostra 3. Toda sequência pode ser visualizada. As sequências em barras azuis representam alta qualidade.
Um total de 151 extrações de DNAg a partir de tecido FFEP foram realizadas, entre outubro de 2011 a janeiro de 2012. Destas 151 extrações 46,3% (70/151) foram amplificadas por PCR. Estes amplicons, depois de purificados com EXO/Sap foram enviados para o sequenciamento, resultando na obtenção de 36,4% (55/151) sequências (veja o gráfico 1).
Gráfico 1:Associação entre o percentual de amostras e os procedimentos utilizados como estratégia para estudo do exon 1 do gene KRAS em amostras de CaVB Fixadas em Formol e Emblocadas em Parafina.
Considerando as 42 amostras, foi possível extrair DNA suficiente para realização da PCR com posterior banda no gel de agarose em 52,3% (22/42) dos pacientes (veja o gráfico 2). Em contrapartida, não foi possível observar, por inspeção visual do gel de agarose, 20 destas amostras. Portanto, algumas amostras de DNA, produtos de PCR, por não apresentar banda positiva no gel foram excluídas nesse estágio do estudo e, não foram submetidas ao sequenciamento automático.
Gráfico 2: Procedimentos utilizados como parte do estudo do exon 1 do gene KRAS em amostras de tecido de Vesícula Biliar canceroso, FFEP. A barra em cinza claro se refere às sequências “pareadas”, direta e reversa.
Depois de analisados todas as sequências do exon 1 do gene KRAS, concluiu-se que nenhuma mutação somáticas pontual foi detectada neste estudo. Essa ausência de mutações
missenses nos codons 12 e 13, foi confirmada por inspeção visual dos eletroferogramas e,
com o auxílio dos programas Sequence Scaner e Chomas Lite, em cada amostra utilizando as sequências com o primer forward e com o reverse.
É notório o fato de que a utilização de amostras de tecidos FFEP para a detecção de mutações é muito influenciada pela metodologia utilizada para a extração e purificação de DNA (LIN et al., 2009). O êxito da técnica de PCR é inerente à sua especificidade (capacidade de reconhecer e não considerar sequências não relacionadas) característica presente nos primers e, sensibilidade (capacidade do método de identificar uma única sequência alvo no substrato e replicá-la milhares de vezes), portanto, cuidados de antemão para minimizar os impactos de várias influências devem ser considerados.
O bloco de parafina contendo o tecido do espécime de vesícula biliar em si é um foco de contaminações por outros microoganismos, portanto, para que se consiga boa amplificação a pureza da amostra é um dos requisitos básicos (VIEIRA, 2006). De fato, a técnica de PCR é suscetível à contaminações o que requer cuidados suficientes para garantir qualidade e integridade a molécula de DNA, objeto deste estudo. Por isso, muita vigilância e medidas de precauções foram tomadas no desenvolver de todos os procedimentos, tanto nas etapas de extração, quanto na pré-amplificação e amplificação das amostras para minimizar ou eliminar o potencial risco de contaminação das PCRs, que de atemão sabia-se que poderia configurar em resultados falso-positivos por contaminação com DNA contemporâneo (VOLKENANDT et al., 1991; STRACHAN et al., 2002). O uso e a troca de luvas cirúrgicas descartáveis em todas as manipulações de uma sala para outra foi uma regra, a desparafinização sempre ocorria na capela de exaustão e, após a extração do DNA genômico o mesmo era congelado em outra sala e no outro dia, na sala de pré-amplificação, após a irradiação prévia do interior da capela de fluxo laminar com luz ultravioleta por no mínimo 30 minutos, iniciava as reações para um Mix, exclusivamente no interior da câmara de fluxo laminar (Veco VLFS 12, Veco do Brasil indústria e comércio de Equipamentos Ltda, São Paulo, SP). A propósito, os materiais como pipetas, ponteiras e tubos da sala de pré-amplificação, eram utilizadas exclusivamente apenas neste local, eram novos e autoclavados, o jaleco, caixas de isopor, etc, também eram de uso exclusivo desta sala. As reações de pré-amplificação também eram feitas apenas em momento que nenhum outro material estava sendo circulado e/ou manipulado nesta sala.
Mesmo diante de um conjunto de precauções, raramente conseguiu-se observar uma banda no gel com mais de 30 nanogramas, advinda de produtos de PCR (exceto a robustez dos controles positivos) inferidos pela comparação com a intensidade de brilho do DNA
Lambda, de 20 e de 40 ng, padrão de massa molecular utilizado com o objetivo de quantificar
estas amostras (GINO et al., 2004). Isso explica porque a maior variação entre os reagentes para a PCR foi na solução de DNA genômico, pois, em média, sua concentração em 1 µL, era de aproximadamente 18,913 ng/µL. Em uma aliquota de 5 µL, esperava-se em torno de 94,565 ng de DNA total, no entanto, está mesma amostra depois de amplificada e, quantificada por ser positiva em gel de agarose a 2%, apresentava uma banda com fluorescência equivalente à 30 ng no máximo, decorrente de 10 µL de produto de PCR corrido no gel. A concentração de DNA genômico empregado no Master Mix (5 µL ~ 94,565 ng) era cerca de três vezes maior que a concentração de DNA de produto de PCR observado nas banda no gel de agarose.
Segundo Gino et al (2004), qualquer afirmação sobre os danos na molécula de DNA associados à conservação da mesma em tecidos parafinados depende de outros estudos experimentais e da concentração do formol, de preferência com grupo controle (GINO et al., 2004). As interações entre o formaldeído e o DNA são conhecidas em seus pormenores, é um estudo que tem se arrastado por décadas, ricamente relatado na literatura (FELDMAN, 1973; SHIBATA et al., 1988; ZIMMERMANN et al., 2008; ), o que se pode dizer é que o efeito destas interações não são bem conhecidas ou esclarecidas (SCHANDER; HALANYCH, 2003).
Desde sua primeira preparação em 1859 (SCHANDER; HALANYCH, 2003), o aldeido fórmico ou formaldeido, tem sido o principal conservante comercializado e utilizado para fixar amostras FFEP, convencionalmente denominado formalina neutra tamponada 10%. A solução é constituída de 100 ml de uma solução aquosa constituida por 37-40% formaldeído; 900 ml de àgua destilada; 4g de Fosfato de sódio monobásico de sódio e; 6,5g de Fosfato de sódio dibásico [anidro] de sódio. Nota-se, que nesta solução aquosa o formaldeído está na concentração de 3,7 a 4% e diluído em tampão fosfato, com pH em torno de 6,8. Nestas condições, está solução de formaldeido ou formol é a mais apropriada para fixar tecidos como a vesícula biliar, por exemplo. Estudos recentes demonstraram que a melhor concentração de formaldeido na solução aquosa (formol) é de 4 a 5% (SCHANDER; HALANYCH, 2003). O pH em torno de 7 (sete) no formaldeido deve ser mantido com adição de fosfatos periodicamente, para evitar precipitação do ácido fórmico no tecido em forma de pigmento marron (SHIBATA et al., 1988; CARVALHO, 2009; HUANG et al., 2010). Esse
artefato é decorrente de fixação de tecido em formaldeido não tamponado e portanto, ácido. Por outra via, o formaldeido exposto à luz se oxida convertendo à ácido fórmico (NILAND et al., 2012) induzindo as hidrólises da ligação n-glicosídica pelas DNA N-glicosilases, que rompe a ligação entre a base (exposta a um agente lesivo) e a pentose e de fosfatos no DNA resultando em ausência de bases púricas (depurinação), com formação de um sítio AP = abásico no local da base removida da sequência de DNA (SHIBATA et al., 1988; GINO et al., 2004; LIBÓRIO et al., 2005; GARCIA et al., 2006; ZIMMERMANN et al., 2008; HUANG et al., 2010). As ligações fosfodiester adjacentes aos sítios AP da base removida podem ser rompidas pela atividade 3’ das APliases (β-eliminação) favorecendo a fragmentação do DNA o que tornam as amostras FFEP semelhantes às fontes escassas em DNA (< 250 ng/µL) pelo seu baixo peso molecular, como já comentado antes no tópico 1.6. A temperatura de incubação a 90 °C por uma hora, na fase de extração do DNA, não era apenas para inativar a proteinase k (para esse propósito muitos estudos utilizaram de tempo bem menor, como 20 minutos ou menos, por exemplo) mas também para reverter parcialmente as ligações cruzadas e amortecer os danos ao DNA (MESQUITA et al., 2001; SCHANDER; HALANYCH, 2003; OKELLO et al., 2010; WEISS et al., 2010).
As amostras de tecido FFEP estão sujeitas à deterioração e a fragmentação do DNA, pela influência do formaldeído principalmente não tamponado (MESQUITA et al., 2001; NILAND et al., 2012), e podem, ocorrer simultaneamente ou separados, mas, a fragmentação do DNA é suficiente para condenar o êxito da reprodução “in vitro” do DNA e o sequenciamento do mesmo (SHIBATA et al., 1988; LIBORIO et al., 2005; GARCIA et al., 2006; ZIMMERMANN et al., 2008; LIN et al., 2009). Em casos de deficiência de DNA de alto peso molecular ou a sequência alvo, os pequenos fragmentos oriundos da fragmentação podem competir com os iniciadores pela taq polimerase e formar dímeros de primers, o que também dificulta a amplificação por PCR (LIBORIO et al., 2005; PEREIRA; SOUZA; DIAS- BAPTISTA, 2008).
A característica referente ao material FFEP aliada à metodologia utilizada para (extração, isolamento e purificação) fins de sequenciamento, se irradia por diversos aspectos qualitativo e quantitativo fundamentais (como a concentração, a contaminação, os danos à molécula de DNA, o comprimento do amplicom, a idade da amostra, etc) para grande influência positiva ou negativa nos resultados finais (MESQUITA et al., 2001; BAREA et al., 2004; COURA et al., 2005; HUANG et al., 2010; NILAND et al., 2012). Mesmo com um protocolo bastante adequado aos reagentes, ao tempo de manuseio e as amostras de DNA detectável nos estratos, ainda assim, é especulação garantir êxito na amplificação de uma
única copia de DNA de tecidos FFEP (OKELLO et al., 2010; CALDART et al., 2011), se o mesmo estiver previamente degradado, mas pode-se minimizar os efeitos negativos desta degradação para o(s) próximo(s) passo(s) da metodologia escolhida (KALLIO et al., 1991; FERNANDES et al., 2004; GARCIA et al., 2006; SIMONATO et al., 2007).
Em casos de amostras FFEP, a sensibilidade da PCR é inversamente proporcional ao comprimento do produto de PCR e ao tempo de armazenamento correlacionadas às condições de conservação das amostras parafinadas, por exemplo, tempo de exposição das amostras a solução aquosa de formaldeído – não tamponado, a altas temperaturas e a humidade (SHIBATA et al., 1988; COURA et al., 2005; GILBERT et al., 2007; ZIMMERMANN et al., 2008; SANTOS et al., 2009; HUANG et al., 2010; HUIJSMANS, et al., 2010; OKELLO et al., 2010; NILAND et al., 2012). A solução aquosa contendo formol a 4% pode chegar a um pH < 1 (LIN et al., 2009), isto é particularmente importante em materiais clínicos com um elevado risco de danos no DNA, tais tecidos (biopsias) se apresentaram como um bom exemplo destes (LIBÓRIO et al., 2005; GARCIA et al., 2006; HUANG et al., 2010).
Como o fragmento alvo desse estudo tem 295 pb de comprimento, assim, trabalhou-se no limite (ou acima dele, dadas as condições das amostras nesse trabalho em particular) em relação à faixa de comprimento recomendada para estudos com material parafinado, essa visão é corroborada com vários achados da literatura pertinente (SHIBATA et al., 1988; PÄÄBO et al., 1989; NASCIMENTO et al., 2003; FERNANDES et al., 2004; GINO et al., 2004; LIBÓRIO et al., 2005; GARCIA et al., 2006; ZIMMERMANN et al., 2008; LIN et al., 2009; OKELLO et al., 2010; NILAND et al., 2012). Sugere-se que outro fator limitante que contribuiu sobremaneira para somar e impedir a amplificação de 47,6% (20/42) das amostras deste estudo é decorrente do fato dos espécimes terem sido fixados em formol não tamponado o que acelera consideravelmente o processo degradativo do DNA nuclear (SHIBATA et al., 1988; NASCIMENTO et al., 2003; SCHANDER; HALANYCH, 2003; COURA et al., 2005; GARCIA et al., 2006; ZIMMERMANN et al., 2008; HUANG et al., 2010; XIE et al., 2011; NILAND et al., 2012). Os espécimes desse estudo foram coletados em anos diferentes o suficiente para o comprometer, em maior ou menor grau, o DNA de suas amostras, sendo a fragmentação do DNA o danos mais relevante (SCHANDER; HALANYCH, 2003; ZIMMERMANN et al., 2008).
Apesar de não ter posse detalhada dos dados referente às datas em que esses espécimes foram biopsados ou extirpados para conservação em formol (não tamponado), sugere-se que aquelas amostras que não amplificaram, de modo algum, foi devido á idade mais avançada, em torno de 15 a 20 anos exposto às condições inadequadas do meio (LIN et al., 2009;
SANTOS et al., 2009). Também é possível que o peso molecular de algumas amostras era tão baixo a ponto de mascarar sua visualização em gel de agarose (ZIMMERMANN et al., 2008), ou o método de isolamento do DNA nestas amostras não foi eficiente para eliminar todos os inibidores da PCR (SANTOS et al., 2009; CALDART et al., 2011).
Antes da padronização da técnica, trabalhou-se com amostras de DNA genômico muito diluídas (entre 1/10 a 1/80) em àgua Milli-Q estéril para evitar o carregamento de inibidores para PCR (CALDART et al., 2011), essa providência funcionou somente na amostra 31. Além da ausência de amplificação, pode-se observar na corrida eletroforética em gel de agarose, um rastro contínuo semelhante a um esfregaço, desde a saída dos poços até a borda oposta da placa de gel (veja a Figura 10), sugerindo DNA degradado (COURA et al., 2005; LIBÓRIO et al., 2005; ZIMMERMANN et al., 2008). Otimizar a técnica empregada na extração de DNA é buscar estratégias que facilite o passo posterior na metodologia, buscando garantia de melhor margem de amplificação de amostras de DNA FFEP, para o diagnóstico molecular.
Quando se trata de sequenciamento de DNA para diagnóstico molecular, o DNA de tecido FFEP, muito degradado com baixo peso molecular, pode gerar artefatos a serem observados no gel de agarose, embora, está observação não esclareça as características referente ao material biológico aliada à metodologia utilizada para prefixação e fixação. Mas, a obscuridade não impede estas mesmas características dinâmicas de se irradiarem em
Figura 10: Fotografias de géis de agarose a 2% com DNA muito degradado. Corado (antes da corrida) com 4 µL de Brometo de Etídeo, pelas fotos da corrida eletroforética evidencia-se DNA, produto de PCR muito degradado (mas sem o perfil de fragmentação internucleossomal por apoptose), com exceção dos controles positvo (CP) nos géis e, do M marcador de tamanho molecular: DNA 1 kb Ladder, nos três géis.
CP C M CN A M CP B M
diversos aspectos fundamentais influenciando a qualidade (concentração, fragmentação, contaminação, danos, etc) do material genético antes, durante e após o emblocamento (LIN et al., 2009).
Acredita-se que a metodologia utilizada para extrair e amplificar DNA eram eficientes e, o sucesso parcial inferidos das amplificações é devido principalmente à conservação insatisfatória do material genético, potencializada pelo tempo de estocagem, apesar de não ser tão claro a interação entre ambas possibilidades e o grau de influência de cada uma, neste estudo em particular (OKELLO et al., 2010).
Curiosamente, em um estudo de 2005, com algumas semelhanças metodológicas a este, os pesquisadores utilizaram 79 amostras de carcinoma retal FFEP, com, no máximo 227 pb e com idade entre 8 e 16 anos de fixação. Destes 79 espécimes, 22 também foram fixadas em formol não tamponado e, neste grupo não houve nenhuma amplificação, enquanto no grupo das amostras fixadas em formol tamponado houve 100% de amplificações (COURA et al., 2005).
É notório o fato de que conseguiu-se estruturar uma técnica de isolamento de DNA genômico destas amostras emblocadas o que possibilitou obter DNA amplificável de boa qualidade, de forma rápida e prática de cerca de 52,3% (22 amplificações em 42) das amostras, com exceção daquelas que amplificaram somente F ou R. Mas, o baixo rendimento numérico das amplificações no conjunto parece ter sido o principal fator que comprometeu de modo relevante o objetivo desta pesquisa no sentido de definir seguramente se há um perfil de mutações nos códons 12 e 13 do gene KRAS em CaVB em brasileiros. No entanto, com mais de 50% das amostras sequenciadas em pelo menos uma das orientações, F ou R, e não detectar mutações nos códons supracitados, nos permite deduzir que no máximo em 47,6% destas amostras poderia ter sido encontrado as mutações mais frequentes no KRAS, mas, com uma probabilidade menor que 1% (dado a frequência de mutações no KRAS em CaVB já conecida).
Uma outra possibilidade para não ter encontrado mutações nas 17 amostras amplificadas e bem sequenciadas, pode ser devido ao fato de mutações no KRAS em CaVB ser muito rara (7 a 10%) e ocorre em fases tardias do processo, a partir de displasia de alto grau, ou até mesmo inesxistentes em pacientes brasileiros.
Portanto, sugere-se que mesmo se houvesse mutações no DNA extraido destes fragmentos e testados neste estudo, estas se encontravam em um nível que não foi possível detectá-las pela metodologia utilizada. Assim, entende-se que é necessário uma outra pesquisa, envolvendo um número maior de amostras para sequenciamento e análise mais
acurada, para que decisões robustas referente á caracterização de um perfil molecular como um fator preditor de prognóstico sejam tomadas, em benefício do paciente brasileiro com CaVB.