Geology

Primers liofilizados (Sigma) foram conservados à temperatura de 4ºC até a hidratação.

Esses reagentes foram centrifugados e em seguida ressuspensos em TE (Tris-HCl – EDTA). Depois da solução de estoque (SE) preparada e identificada em dois frascos rotulados com concentração final de 100 µM. Vortexou-se estes primers separando-os em alíquota de 50 µl da SE retirada de cada um dos microtubos, F e R e estocados em 2 outros microtubos, para diminuir a exposição da SE, diante do uso e assim, evitar contaminação da mesma. Após a manipulação os 4 microtubos foram armazenados em freezer à – 20ºC até o momento de uso.

Fundamentado na literatura e observando alguns critérios qualitativos (SAMBROOK et al., 1989; CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005) foi escolhido um par de primers (BENNETT et al., 2001; FREEMAN et al., 2008; OLINER et al., 2010), para amplificar um segmento de 295 pb (BENNETT et al., 2001), correspondente ao exon 1 do gene KRAS. Os iniciadores hibridizam em regiões intrônicas, afastado por 77 pares de bases da ponta 5’ (“upstrean”) e, 64 pb, da da ponta 3’ (“dowstrean”) região alvo, o exon 1 (BENNETT et al., 2001). Eles não são complementares entre si e em nenhum deles parece ter auto complementaridade (hairpins). Na ponta 3’ tem-se uma G ou uma C (veja a figura 5), para a enzima polimerase iniciar a extensão do primer. Além disso, as temperaturas de anelamento (TA) destes primers são muito próximas (veja a tabela 3).

A literatura sugere que a TA dos primers seja diminuída no máximo em 5ºC, quando necessário, para testá-la como a TM a ser utilizada na amplificação por PCR (CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005).

O conteúdo percentual de C e G, é que determina a TA dos primers, pelo fato de formar três ligações de hidrogênio entre estas bases nitrogenadas, tornando a hibridização nestes sítios mais estáveis, comparadas ao par A/T. Portanto, quanto maior o conteúdo de G e C maior a estabilidade entre os primers e o DNA molde. Neste par tem-se 42,9% (forward) e 40,9% (reverso) de G e C. Os dois primers, F e R (GRIFFITHS-JONES et al., 2005), não apresentam susceptibilidade para formar estruturas secundárias entre si: heterodímero ou dímeros. Selecionar primers bem afastados do exon de interesse foi proposital para evitar perdas de bases nas extremidades do fragmento, pois, as primeiras e últimas dezenas de bases numa sequência, geralmente não apresentam boa qualidade. As características positivas deste par de primers foram verificadas pelo software online Oligocalc e o software OligoAnalyzer. A sequência na integra dos exons do gene KRAS, foram consultadas e estão disponíveis no Banco de Dados - GeneBank (Center for Biotechnology Information - NCBI ).

Figura 5: Sequência de nucleotídeos de um fragmento contendo o exon 1 do KRAS2B (em negrito). Os primers F e R (sombreado com cinza claro) escolhidos para flanquear as regiões intrônicas deste exon com 111 pb (37 codons) do KRAS para amplificação por PCR de um fragmento de 295 pb.

A temperatura de melting utilizada para os primers (direto = 57,2 e reverso = 57,8) nas reações preliminares de PCR já considerava as orientações do fabricante Sigma, em relação à temperatura de anelamento dos primers, e foi ajustada em 3,5 graus abaixo da média de temperatura do par de primers que era de 57,5°C (veja a tabela 3), por também levar em conta as experiências de outros estudos que utilizaram o mesmo par de primers para sequenciar o mesmo exon (OLINER et al., 2010). Alguns sites também foram consultados para verificar por simulção computacional (in siílico) a temperatura de anelamento que deveria ser a melhor para estes primers e oligocalc. Mas, assim que está temperatura foi testada em outro arquivo de amostras FFEP, não foi possível observar amplificação no gel, então, outras três temperaturas de anelamento foram testadas (55, 56 e 57°C) na mesma e em diferentes amostras, até, posteriormente, fixar-se em 56°C a TA dos primers.

Tabela 3: Descrição dos primers utilizados para flanquear o exon 1 do gene KRAS.

Referência Éxon 1 Pb Sequência 5’ » 3’ dos primers Tm dos primers Amplicon OLINER et al.,2010 1F: direto 1R: reverso 21 5’-AAGGTACTGGTGGAGTATTTG-3’ 57,2°C 295 pb 22 5’-GTACTCATGAAAATGGTCAGAG-3’ 57,8°C

Logo em seguida, testou-se os oligos da solução de trabalho (ST) em amostras oriundas de DNA genômico de tecido fresco, submetendo-os à técnica de PCR para certificar e documentar a eficiência dos primers em amplificar essa região. Com essa PCR, aqui denominada de PCR teste, foi possível constatar por inspeção visual, a amplificação do exon 1 do KRAS, através da presença de bandas no gel de agarose a 2%, em tampão TBE, corado com 4 µL de brometo de etídio (Br.Et) (Invitrogen Life Technologies, CA, USA) (SAMBROOK et al., 1989; LIBORIO et al., 2005).

GTATTTTGAAATAATTTTTCATATAAAGGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGGTGGAGTATTTGA TAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGG CCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGT GCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGG TAAATCTTGTTTTAATATGCATATTACTGGTGCAGGACCATTCTTTGATACAGATAAAGGTTTCTC TGACCATTTTCATGAGTACTTATTACAAGATAATTATGCTGAAAGTTAAGTTATCTGAAATGTA

A positividade das bandas no gel era uma prova de que os primers e os reagentes eram eficientes em qualidade e quantidades, para extrair um segmento de DNA de 295 pb, oriundo de amostras frescas. Com o objetivo de padronizar uma metodologia que atendesse as características peculiares de nossas amostras, passou-se, então, a reproduzir estes mesmos passos, em amostras extraídas de DNA genômico oriundo de fragmentos de tecidos (biopsias tumorizadas) fixados em formaldeído ácido e parafinado (FFEP). Muito cedo, percebeu-se que a metodologia padronizada para amplificar as amostras de tecido fresco era ineficiente para a mesma função em tecidos FFEP. Abaixo segue a melhor padronização encontrada para a maioria das amplificação com sucesso. Os reagentes componentes do Master Mix utilizados no preparo da PCR, em tecido FFEP, estão descritos (veja a tabela 4).

Para a PCR, cada Master Mix com volume final de 280 µL (já descontadas as perdas retidas nas ponteiras das pipetas), era dividido em 13 tubos de reação (de 0,2), com 20 µL cada, assim distribuidos: Dez amostras de DNAg; um (1) tubo para controle negativo (CN), que continha a mesma mistura da reação, exceto o DNAg, sua quantidade era substituída por água deionizada (Milli-Q autoclavada). Além do CN um ou dois (1 ou 2) tubos para controle positivo (CP) no qual era adicionado DNA de sangue fresco. A integridade e a qualidade das amostras assim como dos reagentes e dos controles utilizados no Master Mix, eram verificadas por PCR utilizando-se também dos primers para amplificar o exon 1 do KRAS.

Tabela 4: Volumes pipetados, concentração final dos reagentes da solução de PCR.

Reagentes e Concentração 1 vol (µl) 14 Vol (µl) Concentração final H2O Mili-Q autoclavada (q.s.p) 11,0 µL 154 µL

Tampão 10x IB MgCl2 15mM 2,0 µL 28,0 µL 1X 2,5 mM de MgCl2

dNTP (2,5 mM= total 10 mM =10000 µM) 1,0 µL 14,0 µL 200 µM ou 0,2 mM*

Primer F e R (5µM ou 5 pmoles/µL) 1,6 µL 22,4 µL 8 µM ou 8 pmol/µL

BSA 2,5 mg/mL 0,2 µL 2,8 µL 0,9 mg/mL

Taq (Platinum) DNA Pol. (5u/µL) 0,2 µL 2,8 µL (1U)

**DNA (75,652 ng) 4,0 µL 56,0 µL 18,913ng/µL

* Cada um. **A determinação da concentração estimada de cada amostra de DNA genômico, foi calculada pela média

aritmética acompanhada do desvio ou erro padrão de ± 3,854, cuja concentração girava em torno de 15,059 a 22,767 ng/µL.

Todos os reagentes contidos na tabela 2, foram pipetados na sala de pré-amplificação, diretamente no “coquetel” e nesta ordem dada pela tabela, como uma constante. Mas, o protocolo, para amplificação por PCR do DNA de amostras FFEP, sofreu várias modificações

no decorrer do tempo, com o intuito de ajustar a metodologia para melhorar a amplificação. Passou-se então, a fazer duas reações quanti-qualitativamente, exceto um dos reagentes, cuja quantidade era alterada, em uma das reações, em função de buscar o reflexo dessa alteração por observação do gel de agarose que confirmaria ou não a amplificação.

Na PCR teste, usamos 0,1 µL de BSA por reação, mas, pressupõe-se que a atividade da taq polimerase em tecido FFEP é reduzida devido ao alto potencial de contaminação das amostras, assim, optou-se por torná-la mais permissiva dobrando a quantidade de BSA. A Taq

DNA-polimerase inicialmente usada (5U/ l, Phoneutria Biotechnology. & Services – Lote:

0028), foi trocada pela Taq Platinum (Invitrogen®, Lote: yF1B1a) do tipo hot start que otimiza a especificidade, sensibilidade e a qualidade do produto de PCR (VIEIRA, 2006; ROBERTSON et al., 2007). Utilizando-se está taq, foi possível diminuir 1 µL em cada tubo de reação e observar um rendimento prático na intensidade de algumas bandas. Em relação aos dNTPs (2,5 mM de cada), no curso dos experimentos sua quantidade variou de 0,8 a 1,5 µL, até fixar em 1 µL, por tubo de reação. Algo semelhante ocorreu com o par de primers, estocados inicialmente numa solução de trabalho a 8 µM/µl, da qual uma aliquota de 0,4 µL era pipetada para a PCR teste. Mas, 0,8 µL (estocados à 5 µM/µl) foi mais eficiente para o

Mix com o DNA oriundo de tecido FFEP, mesmo observado o excesso de primers na borda

(“positiva”) de vários geis.

O tampão utilizado (Phoneutria Biotechnology & Services – lote: PB0019), cuja concentração MgCl2 (mM)3 é: 500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,4; 1% Triton X-100;

15,0. Como se pode notar este tampão contém o cloreto de magnésio e a quantidade utilizada na reação permite uma concentração ideal, normalmente não precisa ser alterada. Mas no decorrer dos experimentos foi observado que o número de bandas no gel eram poucas e geralmente fracas, então foi adicionado no Master Mix para PCR 0,5 µL de cloreto de magnésio em cada tubo de reação (cuja concentração ótima está delimitada entre 0,5 a 5 mM), no intuito de otmizar a reação e a qualidade dos produtos de PCR, sem aumentar a temperatura de anelamento (CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005). No entanto, nenhuma melhoria foi notada e passou-se a usar apenas a concentração de MgCl2 presente no tampão.

A maior variação ocorreu com a quantidade utilizada de DNA genômico para o Master Mix de PCR. Está variação foi de 2 µL (100 ng/µL, na PCR-teste) para um máximo de 5 µL, com aproximadamente 94,565 ng de DNA genômico obtido da solução eluida na extração de DNA parafinado (COURA et al., 2005), ou seja, 18,913 (±3,854) ng/µL é a concentração das amostras de DNA genômico averiguada por fluorimetria. Num estudo anterior a esse, foram utilizados no Master Mix entre 100 a 400 ng de DNA, oriundo de material FFEP, em 25 µL de

cada tubo de reação (LIBÓRIO et al., 2005). DNA de amostras FFEP, livre de impurezas e de inibidores da PCR, pode ser amplificado, desde que sua concentração no Mix corresponda a um mínimo de 5 µg/mL (5ng/µL) (VIEIRA, 2006; DO; DOBROVIC, 2012), ou mais que 3 ng/µL (MIRSHAHABI et al., 2007; MIRMOMENI et al., 2010).

Em relação ao programa para amplificação por PCR (veja a tabela 5), iniciou-se com 35 ciclos e posteriormente alterando para 40 ciclos e fixando nisso (LIBÓRIO et al., 2005). O ciclo de extensão, referente ao programa de termociclagem, foi esticado entre 4 e 7 minutos (LIBÓRIO et al., 2005; MIRSHAHABI et al., 2007; AUSCH et al., 2009), com o intuito de evitar que alguns produtos não fossem amplificados (CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005). A amplificação foi realizada em termociclador GeneAmp 9700 (Applied Biosystems).