Cerca de 95% das mutações patogênicas, nos codons 12 e 13 do gene KRAS são identificadas em tumores malignos (LAZCANO-PONCE et al., 2001; WISTUBA; GAZDAR,
2004; SAETTA, 2006; AUSCH et al., 2009; SEIXAS; COLLARES, 2011; SHEN et al., 2011), é o proto-oncogene encontrado com maior incidência de mutações somáticas ativadoras em cânceres humanos é o KRAS (HOUSTON, 2001; HACHISUGA et al., 2005; MULLIN, 2005; AUNER et al., 2009). Mutações somáticas ativadoras neste proto-oncogene leva-o a ativação com ganho de função ou superexpressão.
Três fenômenos genéticos são responsáveis por contribuir entre se para o aparecimento destes perfis ou standers mutacional por substituição de base: (a) uma das quatro bases é convertida em outra de acordo com as influências do meio; (b) as proteínas reparadoras de DNA danificadas e; (c) se o DNA mutado não é reparado resulta em alterações biológicas.
A isoforma comumente mutada esporadicamente adquirida em cânceres humanos é oriunda do KRAS2B, donde decorrem mutações somáticas missenses nas posições codantes 12, 13, 59 , 61, 63, 117, 119 e 146, estes aminoácidos circundam o bolso de catálise do GTP na proteína KRAS (FIORDALISI et al., 2003; JANCIK et al., 2010).
De acordo com a literatura analizada, o KRAS2B está associado à diversos cânceres nas seguintes propoções: pâncreas (90%), colo-retal (40%), pulmão (30 a 50% dos casos), tireóide (50%), leucemias mielóide (30%), mama (5%) e outros como pele, bexiga, vesícula biliar, fígado, endométrio, colo do útero, e outros (TYNER et al., 2009; NAGUIB, 2011). Porém, várias outras mutações missenses (patogênicas) associadas à cânceres diversos já foram relatadas nas posições 146 (A146T) para câncer de colo retal e; posições incomuns tanto para leucemias mielóides (74, 141, 146), quanto para Síndrome Noonam (14, 34, 58, 153, 156) outros resíduos também são trocados (TYNER et al., 2009). Mutações no exon 6 do KRAS2B foram reportadas em indivíduos com diversas síndromes, inclusive a síndrome de Noonan (CARTA et al., 2006).
Mutações missenses nos codons 12, 13 e 61 ativando o proto-oncogene KRAS e emergindo na via ras aberrante foram encontrados em cerca de 80-90% dos cânceres de pâncreas (NAGUIB, 2011). O montante de mutações no KRAS pode ser útil como uma ferramenta para auxiliar no diagnóstico de câncer de pâncreas (HACHISUGA et al., 2005).
De acordo com Ogino et al (2009), estudos de base populacional tem demonstrado que cerca de 30% a 50% dos cânceres de colo-retal abrigam mutações pontuais nos três codons supracitados, e menos comumente no codon 146 das mutações relatadas para o KRAS (FENG et al., 2011) e, mutações nos codons 12 e 13 é sugestivo de pior prognóstico (EDKINS et al., 2006).
Mutações acumuladas em diferentes vias moleculares envolvendo diversos genes, em particular o KRAS, num estágio adenomatoso avançado e precoce da carcinogênese em múltiplas etapas (FEARON; VOLGELSTEIN,1990), também está associado à progressão do câncer de colo-retal por transformação da mucosa retal normal em maligna, com a mutação mais frequente p.Gly12Val, associada a um pior prognóstico e menor sobrevida com maior probabilidade de recorrência (JONSSON et al., 2009; FENG et al., 2011).
O câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC), responde por 80% dos dois tipos histológicos primários de câncer de pulmão. Há mais de 20 anos se sabe que no CPNPC os dois proto-oncogenes mais comumente encontrados mutados são os oncogenes KRAS (codons 12, 13 e 61) e o RFCE- receptor de fator de crescimento epidérmico (EDKINS et al., 2006; WEINBERG, 2008). Acredita-se que as mutações no KRAS estão associadas à prognóstico ruim em câncer de pulmão avançado. Estudos tem reportado que a exposição ao tabaco é um nexo para esse câncer e mutação pontual ativadora do KRAS nos codons 12 e 13 é incidente em cerca de 97% dos CPNPC, destes, 90% são adenocarcinomas de pulmão. Mutação no KRAS em células escamosas de pulmão é muito raro (RIELY; MARKS; PAO, 2009).
As leucemias mieloide aguda (LMA) são um grupo de doenças neoplásicas muito heterogêneas, com mutações cromossômicas e gênicas. A evolução de eventos mutagênicos até a gênese da LMA decorre de mutações nos mesmos hot spots tradiconais conhecidos com acréscimo para o codon 146 do KRAS (SABNIS et al., 2009). Conclui-se que esses quatro aminoácidos “titulares” são essenciais para a proteína KRAS gerir sua função catalítica normal, no entanto, mutações pontuais nestes codons estão comumente associadas às agressivas LMA em 25-30% dos casos esudados (EDKINS et al., 2006; AHMAD, 2009).
O KRAS é um dos gene candidatos a mutar com ganho de função ativadora e está associado à 90% dos cânceres mieloproliferativos como as leucemias mielomonocíticas crônica e da primeira infância ou juvenil (LMMC e LMMJ) estas doenças por sinal são muito agressivas e letais (SABNIS et al., 2009), e não são sensíveis a quimioterapia convencional. A LMMJ e LMMC resulta de distúrbio na via efetora RAS/RAF/MEK/ERK com mutação no codon 12 (G12D), “assinatura molecular” de malignidade podendo evoluir para LMA (CUTTS et al., 2009; LYUBYNSKA et al., 2011).
Em leucemia mieloide aguda (LMA), além dos hot spot tradiconais já conhecidos (nos codons 12G, 13G e 61Q), mutações adicionais ativadoras do KRAS, foram reportadas também para o codon A146 (ALA), no domínio GEF (fator de troca nucleotídeo guanina – região G-5 [AA144-146]). Estes quatro aminoácidos “titulares” são essenciais para a proteína KRAS
gerir sua função catalítica, no entanto, alterações genéticas nestes codons são encontradas em cerca de 25-30% das LMA, sendo as mutações mais comuns e agressivas (EDKINS et al., 2006; AHMAD, 2009).
Os tumores malignos da tireóide representam 1% de todos os demais cânceres, sendo o adenocarcinoma de tireóide o mais incidente. Os principais tipos histológicos de câncer da tireóide são: papilar (PTC), folicular (FTC), anaplásico (ATC) e o adenoma benigno da tireóide (BTA) é o mais comum. O carcinoma do epitélio folicular da tireóide (FTP) é um dos tumores de tecido sólido mais agresivos, cuja incidência é de 5 a 10% dos carcinomas de tireóide, com sobrevida média de 3 a 7 meses. Acredita-se que o FTP resulta de eventos mutagênicos sequenciais englobando mutações ativadoras do KRAS nas fases iniciais da tumorigênese (MACIEL et al., 2005). O status mutado do KRAS não é eficiente como um preditor de prognóstico em Ca de tireóide (MACIEL et al., 2005).
O câncer gástrico intestinal (CGI) é o quarto mais frequente no mundo e o segundo com maior número de vítimas de morte. O KRAS mutado é encontrado em 10% deste processo carcinogênico de múltiplos passos, cuja taxa de sobrevida nos EUA, é de 21% em qualquer tipo histológico (intestinal ou difuso). O status mutado do KRAS (G12C ou G12S) é observado na etapa inicial da tumorigênese do CGI, como um preditor do aumento de p21RAS associado à estágios sequenciais histopatológicos (eventos pré-neoplásico: hiperplasia, atrofia e metaplasia epitelial [mucosa gátrica a mucosa intstinal secretora]) e progressivos que se orientam para malignidade de pior prognóstico (MATKAR et al., 2011). Mutações ativadoras do KRAS são encontradas entre 20 - 50% dos cânceres de estômago e também pode ser detectada em esofago de Barret. Entre todos os tecidos que o KRAS pode ser induzido à mutação ativadora o estômago parece ser o mais sensível (MATKAR et al., 2011).
O carcinoma de “pele” não melanoma é o câncer dermatológico mais comum no Brasil, e o sexo não é fator predisponente, geralmente não produz metástase e, é classificado histologicamente em espinocelular e basocelular. O carcinoma basocelular é o mais diagnósticado nos EUA. Ao contrário o melanoma é o carcinoma de pele mais agressivo e com pior prognóstico. Este câncer resulta comumente da disfunção da via Ras (RAS/RAF/MEK/ERK), na qual o KRAS é encontrado mutado em 2% dos melanomas e segundo os modelos animais essa mutação pode ser um dos eventos que contribuem para a tumorigênese de carcinoma de pele (MILAGRE et al., 2010).
Diversos estudos tem mostrado que mutações no proto-oncogene KRAS estão presentes em 5% dos carcinomas de mama, considerando os cinco subtipos moleculares (SANCHEZ-MUNOZ, 2010). Mutações no codon 12 relacionado ao câncer endométrial é a
mais frequênte relatada (HACHISUGA et al., 2005). No câncer de ovário seroso e mucinoso (borderline de baixo grau [via I]), as alterações moleculares mais bem caracterizadas, são as mutações (mutuamente exclusivas) de maior incidência encontradas nos proto-oncogenes
KRAS e BRAF, essas mutações evoluem lentamente a partir de adenofibromas com o KRAS
mutado (codons 12 e 13) no início da tumorigênese. Geralmente, são detectadas em estágio já bem avançado, com processo de invasibilidade de baixo grau em 1/3 dos borderline e 1/3 dos micropapilares (VANG; SHIH; KURMAN, 2009). Mutações no gene KRAS, codons 12 e 13, são as alterações genéticas encontradas com alta frequência em carcinoma de ovário e não respondem bem a terapias alvo. Na Europa o câncer de ovário foi reconhecido em 2005, pela OMS (Organização Mundial de Saúde), como o 5º câncer com maior número de óbitos (AUNER et al., 2009). Além dessas mutações somáticas uma variante germinativa do KRAS também pode ser encontrada em câncer de ovário assim como em carcinoma oral escamoso (KEANE; RATNER, 2010).
O câncer de bexiga é o 4º carcinoma de maior incidência nos EUA, responsável por muitas vítmas com morte. Mutações ativadoras do KRAS tem sido associadas a tumorigênese do carcinoma de bexiga e extensivamente registradas na literatura (NANDA et al., 2010)
O KRAS mutado no codon 12 também é mais comum nos colangiocarcinomas (CC) relacionado aos codons 13 e 61, porém, G12D, é a mutação mais frequente (ao invéz de G12T). A incidência de KRAS mutado em CC em ingleses é de 100%, felizmente é um câncer raro do sistema hepato-biliar. Em CC o status mutado do KRAS pode ser usado como um preditor de localização e de etiologia do tumor (OKUDA; NAKANUMA; MIYAZAKI, 2002). O carcinoma hepatolcelular (CCI), cujas mutações também tem preferências muito semelhantes ao colangiocarcinoma, exceto pela mutação no codon G12C. Sua maior expressão ocorre na fase precoce da carcinogênese. Nos pontos mais baixos da árvore biliar e está relacionado a metástase linfonodal, status mutado do KRAS associado a pior prognóstico (KUMAR; ZHAO; WANG, 2011).
Entre as moléculas de sinalização celular a proteína KRAS tem sido uma das mais estudadas ultimamente (BAR-SAGI, 2001; FEHRENBACHER; PHILIPS, 2009). Os genes Ras canônicos, com ênfase para o KRAS2B, hoje são reconhecidamente o maior exemplo de biomoléculas envolvidas na homeostasia celular da tumorigênese e na manutenção da mesma em diversos cânceres, sendo o oncogene mais comumente mutado em cânceres humano (HOUSTON, 2001; ALBERTS et al., 2006; WANG, 2011). Estudos reportaram que o KRAS está envolvido em mutações diversas com ganho e perda de função através de exclusão,
transição/transversão (veja a figura 3), duplicação, IMS, translocações, promoção de metilações e amplificação gênica (ALBERTS et al., 2006; RIELY, MARKS; PAO, 2009 ).
Figura 3: As mutações patogênicas somáticas mais comuns no exon 1 do gene KRAS.
Mutação Missense Mudança de base Tipos 5’GGAGCTGGTGGCGTAGGC3’ Gly12Ala (GGT>GCT) *Transversão GGAGCTGCTGGCGTAGGC Gly12Asp (GGT>GAT) Transição GGAGCTGATGGCGTAGGC Gly12Leu (GGT>CTT) *Transversão GGAGCTCTTGGCGTAGGC Gly12Val (GGT >GTT) *Transversão GGAGCTGTTGGCGTAGGC Gly12Arg (GGT>CGT) *Transversão GGAGCTCTTGGCGTAGGC Gly12Cys (GGT>TGT) *Transversão GGAGCTTGTGGCGTAGGC Gly12Ser (GGT>AGT) Transição GGAGCTAGTGGCGTAGGC Gly13Asp (GGC>GAC) *Transversão GGAGCTGGTGACGTAGGC Gly 13 Cys (GGC>TGC *Transversão GGAGCTGTTTGCGTAGGC
Estes são os mecanismos genéticos regulatório associados à alterações da expressão do gene (i.e. desregulação do promotor transcricional) e/ou da estrutura da oncoproteína codificada e correlacionada á proliferação celular através de interações entre célula-célula (WEINBERG, 2008).
Essas mutações ocorrem em diversos codons mas estão registradas na literatura como regiões de “hot spots” 12G (35G>T;GGT>GTT; p.Gly12Val) (JONSSON et al., 2009; FENG et al., 2011), 13G (38G>D; GGC>GAC; p.Gly13Asp) da fase de leitura aberta - open reading
frame - ORF (AHMAD et al., 2009; RIELY, MARKS; PAO, 2009; KULSUM et al., 2011).
No exon 1, a maioria destas mutações ocorre em um único sítio, a segunda base do codon 12 e são transversões G → T (SAETTA, 2006; SHEN et al., 2011). As potenciais alterações na terceira base tanto do codon 12 quanto do 13, produzem mutações silênciosas - não patogênicas (AUSCH et al., 2009; CHANG et al , 2009). Mutações somáticas nos codons 12 e 13 bloqueiam a hidrólise intrínseca da proteína KRAS ligada ao GTP resultanto em uma oncoproteína muito ativa induzindo sinalização constitutiva na principal via do KRAS, a Ras/MAPK (WISTUBA; GAZDAR, 2004; JANCIK et al., 2010).
Vários estudos tem relatado que este gene mutado está associado à diversos cânceres de tecido sólido em humanos e tem sido implicado na patogenia de muitos tumores (veja a figura 4) (WANG et al., 2011). Segundo o banco Cosmic, 30% das mutações somáticas em câncer do trato biliar humano também estão associadas ao KRAS2B.
Estudos recentes mostraram que o status mutado do KRAS2B além de auxiliar no prognóstico é promissor na resposta terapêutica (CHANG et al., 2009), estes são alguns dos aspectos que deram origem ao presente trabalho. A fisiologia patológica decorrente das mutações podem levar a transformação maligna com características típicas de células cuja arquitetura foi transformada, como: alteração do citoesqueleto, aumento da motilidade celular, crescimento celular desordenado com perda de adesão (célula-célula-matriz), polaridade e da inibição por contato, eventos associados à metastização e imortalidade celular (FIORDALISI et al., 2003; FRIDAY; ADJEI, 2005; KYRIAKIS, 2008; JANCIK et al., 2010).
1.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR EM TECIDO FIXADO EM FORMOL E EMBEBIDO