(Qiagen®, Hilden, Alemanha) com adaptações decorrentes de erros e tentativas da prática cotidiana, foi se adequando o método na busca de eficiência para extrair e amplificar DNA.
Materiais de arquivo biológico exije alguns cuidados relevantes no processamento para que muitos dados não sejam obscurecidos pelas influências do ambiente, cuja fonte de DNA esta sujeito. De fato, quando se trabalha com amostras de DNA de tecidos FFEP, cada etapa precedente da metodologia, pode ser um indicador do insucesso da etapa posterior, embora não defina o êxito do processo pode definir os aspectos qualitativos e quantitativos da fonte de DNA (MESQUITA et al., 2001), inclusive limitá-la por completo.
A etapa de desparafinização foi feito na capela de exaustão (CE 0701 - Permution E.J.Krieger & Cia Ltda), após desinfecção do interior da capela, acrescentou-se a cada um dos tubos (com no máximo 3 cortes da mesma amostra por vez, para diminuir o risco de contaminação durante a manipulação) de 1,5 mL contendo os fragmentos de tecido em fita de
parafina 1mL de Xilol puro (Merck S/A Indústrias Químicas, Rio de Janeiro, RJ). Na fase de dissolução e remoção da parafina foi adicionado subsequentemente 1 mL de Xilol (reagente aromático dimetilbenzeno) em dois ou três banhos seguidos, na mesma concentração (COURA et al., 2005; GILBERT et al., 2007; MIRMOMENI et al., 2010).
Para remover os resíduos de Xilol, utilizou-se etanol em concentrações decrescentes para cada etapa (95%, 70% e 50%, respectivamente) de ressuspenção, hidratação do pellet, vortexação e centrifugação (centrífuga Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). Na maioria das vezes dois banhos de etanol eram suficientes para remover a parafina. Quanto mais banhos em xilol e etanol melhor, no entanto, também é maior o número de centrifugações assim como as perdas de DNA descartado ao pipetar e, pela potencialização da contaminação e degradação (SCHANDER; HALANYCH, 2003; MIRSHAHABI et al., 2007; VILANOVA-COSTA et al.,2008; MIRMOMENI et al., 2010; WEISS et al., 2011). Mesmo diminuindo a concentração de etanol na solução aquosa até utilizar água bidestilada e tirar proveito da maior densidade da água em relação ao etanol para pipetar, ajuda a diminuir as perdas, mas ainda não as anulam. A molécula de DNA não é solúvel em álcool e, portanto, tende a formar um aglomerado de moléculas precipitadas quando em meio alcoólico. A precipitação com etanol absoluto favorece a concentração do DNA, enquanto a ressuspenção do pellet de DNA em etanol a 70% favorece a remoção de resíduos de sais e a retirada do etanol com a pipeta é um procedimento fácil. Mas é necessário que todo restante de traços de álcool não pipetado seja evaporado para evitar que o mesmo interfira em reações enzimáticas posteriores.
Então, os tubos de polipropileno eram deixados abertos com o produto da dissolução do tecido de 20 a 40 minutos de ponta-cabeça, fixados em um suporte de isopor (para evitar contato com a abertura no tubo) a temperatura ambiente dentro da capela de exaustão. Um papel toalha era colocada abaixo do suporte de isopor para perceber melhor o possível gotejamento dos tubos e a consequente perda de material decorrente desta fase, mas, o etanol remanescente das lavagens da amostra pode inibir a PCR.
Na etapa seguinte, adicionou-se em cada microtubo de 1,5 mL, 180 µL de tampão ATL (Tissue Lysis Buffer) e 20 µL de proteinase K (25 mg/1,25 mL) para a lise completa da amostra do tecido. Após misturar no Vortex (QL 901), a incubação era feita a 56oC, por 1 hora (segundo as orientações do fabricante), num thermomixer, mas, neste estudo o tempo mínimo na maioria das vezes foi de 3 horas, com 2 agitações por inversões dos tubos somente quando menos tempo não era suficiente para dissolver completamente todo o pellet e romper as membranas celulares, as amostras ficavam em overnight (LI et al., 2008; VILANOVA- COSTA et al., 2008; MIRMOMENI et al., 2010; OKELLO et al., 2010; WEISS et al., 2011).
A literatura específica relata que o tempo de digestão com proteinase K varia entre 1 hora até 5 dias (MESQUITA et al., 2001; BAREA et al., 2004, CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005; MIRMOMENI et al., 2010; SCORSATO; TELLES, 2011), ou até observar um líquido de cor palha e viscoso ou o sobrenadante gerado na etapa de lise. Algumas vezes, após a digestão, a presença de um aglomerado esbranquiçado depositado no fundo do tubo era observado o mesmo era descartado para não ser carreado para a fase seguinte, não sendo, portanto, relevante. Além deste aglomerado não foi observado resíduos de parafina, nesta etapa do processo (SANTOS et al., 2009).
No próximo passo as amostras foram incubadas a 90°C durante 1 hora (no máximo) para inativação da proteinase K (BAREA et al., 2004) e concomitante reversão parcial por hidrólises das ligações cruzadas entre macromoléculas (processo denominado recuperação antigênica, utilizado para “desamarrar” o DNA e favorecer a PCR) oriundas do processo de fixação com o formol não tamponado (cujo teor de seu metabólito, o ácido fórmico era desconhecido) (SCHANDER; HALANYCH, 2003; FERNANDES et al., 2004; GILBERT et al., 2007; LI et al., 2008, MELO et al., 2010; OKELLO et al., 2010; WEISS et al., 2011; NILAND et al., 2012). Em seguida optou-se pela adição de RNAse (passo opcional) que potencialmente impede que moléculas de RNA interfiram nas reações enzimáticas de amplificação e sequenciamento (WEISS et al., 2011).
As orientações do fabricante do kit sem alterações para precipitar s proteínas e isolar o DNA genômico daqui para frente foram seguidas, optando-se sempre por combinar os 400 µL de tampão AL e etanol a 96% em um tubo de 2,0 mL esterilizado, vortexar antes de usár.
O kit utilizado para extração, precipitação, isolamento e captação do DNA genômico purificado, consta também de um tubo com uma coluna (QIAamp Spin Column), de fragmentos de sílica (CALDART et al., 2011). A coluna tem uma membrana na porção inferior onde o DNA se adere para purificação. A extração se dá por meio de lavagens sucessivas com tampões, agitação em vortex, precipitação por centrifugações e eluições por adição de sucessivos tampões. A remoção dos remanescentes celulares e resíduos contaminantes no lisado era feita recorrendo-se às colunas e o descarte do lavado no tubo suporte. O DNA do tecido lisado ficava retido por afinidade na coluna de sílica e o filtrado era novamente descartado, estas etapas se repetiam até transferir a coluna de sílica para um novo microtubo de 1,5 mL, o qual era centrifugado por 3 minutos a 13,2 rpm (18.85 x g.) e colocado para secar ao máximo a membrana (e em caso de filtrado remanescente este era descartado). O DNA puro e concentrado era eluído a partir da membrana, em 30 ou 50 µL de tampão ATE (Tampão TRIS (10 Mm) -EDTA (1 mM) e pH 8,0), de acordo com o manual do
kit. Mas, a eluição era feita com água milli-Q autoclavada – deionizada (FERNANDES et al., 2004; CURY; FURUSE; ARAÚJO, 2005; MIRMOMENI et al., 2010), sempre que se sabia de antemão, que esse DNA seria amplificado em cerca de 24 horas após sua eluição (MELO et al., 2010; CALDART et al., 2011). Os tubos com produtos de extração eram congelados a 20°C negativos, em alíquotas para evitar o descongelamento repetitivo e a consequente degradação do DNA (eluído sem o tampão) e, somente após cerca de 24 horas eram descongelados e usado para PCR.
O DNA purificado pode ser armazenado por cerca de 7 meses em tampão de eluição contendo TRIS-EDTA, pH em torno de 7,2 a 15°C e, por cerca de 12 meses com temperatura entre 2 a - 8°C e na ausência de DNAse (MELO et al., 2010).