O software Sequence Detection System (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) usou a medição da fluorescência para plotar os valores de sinal (Rn) para cada poço. Esta identificação de sinal indicou quais alelos estão presentes em cada um dos poços da placa.
4.4.2 MLPA
As análises dos dados do MLPA ocorreram em dois programas: GeneMapper (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) e Coffalyser v. 9.4 (MRC Holland, Amsterdam, Holanda). O primeiro fez um tratamento prévio dos resultados, traduzindo as imagens (picos) em uma planilha numérica, para que os dados pudessem ser exportados para o Coffayser, ferramenta de análise projetada para fornecer uma normalização confiável e robusta sobre CNVs nas amostras investigadas.
Figura 11: Software Coffalyser.
Uma das telas do Coffalyser evidenciando a intensidade de cada pico, produzido pela fluorescência de seus primers. Cada pico representa uma região investigada. Sua intensidade é proporcional ao número de cópias no genoma, porém, para se avaliar estas alterações é necessário realizar normalizações com amostras referências. Todas estas análises são feitas no próprio software da MRC Holland.
No Coffalyser, foi possível realizar até quatro tipos de normalizações: análise da altura ou da área do pico combinadas com análise populacional ou com amostras controle. As normalizações foram feitas pela razão da intensidade das sondas referência das amostras controles e a intensidade das sondas referência das amostras testes.
De forma semelhante, o software também fez as razões entre as sondas de investigação. Somado a isso, o software também fez regressão linear (função logarítmica) dos dados gerados no sequenciador para diminuir os valores absolutos das diferenças entre as amostras. Todos estes artifícios utilizados pelo coffalyser têm por objetivo diminuir a diferença entre as intensidades dos sinais das amostras, para se poder chegar ao diagnóstico seguro.
Estas normalizações produziram gráficos em forma de barra, onde foi possível distinguir deleção, duplicação ou mesmo triplicação de uma região. As intensidades (medidas no eixo y) normais tendem a se aproximar de 1,0 (± 0,2), deleções tendem a se aproximar de 0,5 (± 0,2), triplicações 1,5 (± 0,2).
4.4.3 Sequenciamento
Os resultados de sequenciamento foram analisados por diversos programas em duas etapas distintas. A primeira análise foi feita somente com as sequências em
formato FASTA, enquanto outra análise independente e mais detalhada foi feita a partir dos dados dos eletroferogramas.
A análise preliminar contou com três softwares: Phred Quality Scores (University of Washington, Seattle, WA, EUA), Bioedit (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA, EUA) e Clustal (University College Dublin, Dublin, Irlanda). Através do Phred, fez-se o base calling, com nível de confiança mínimo (20) para garantir a qualidade das sequências analisadas. Assim, esta ferramenta garante uma análise mais segura das sequências, uma vez que os picos não estão sendo observados. Em seguida os arquivos foram exportados em forma de FASTA pelo mesmo software.
O Bioedit possibilitou a edição das sequências, para que apenas éxons e sítios de splicing fossem analisados, cortando assim, sequências indesejáveis de regiões intrônicas que poderiam atrapalhar no alinhamento múltiplo (global). Este alinhamento, por sua vez, foi realizado com o auxílio do Clustal.
O alinhamento das sequências nas duas direções (direto e reverso) permitiu a identificação preliminar de prováveis candidatos a SNPs ou mesmo mutações. A alta frequência de bases discordantes com a sequência referência poderia indicar um SNP, enquanto a baixa frequência poderia indicar uma mutação. Porém, para a confirmação destes candidatos, estas bases discordantes foram confrontadas contra os bancos database Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP) e bancos de mutações como o Online Medelian inheritance in Man (OMIM) e Leiden Open Variation Database (LOVD) (FOKKEMA; DEN DUNNEN; TASCHNER, 2005).
Mutações em homozigose são mais facilmente identificáveis pela análise acima, porém, é de se esperar mutações em heterozigose em SHOX; e heterozigose composta, heterozigose com efeito dominante negativo no GHR (BOGUSZEWSKI, 2001; BONIOLI et al., 2005; ROSS et al., 1997). Em todas estas situações os picos são produzidos em heterozigose e devido à cobertura de 2x do sequenciamento não existia a garantia de que os arquivos em FASTA (gerados pelo Phred) identificassem a base mutada em vez da base normal para estas situações, visto que ele identifica uma única base por pico, mesmo que o eletroferograma indique duas fluorescências. Por isso, foi necessário, também, a observação de todos os eletroferogramas. Para isso, usou-se o software DNA Workbench (CLC Bio, Aarhus, Dinamarca), que permite o alinhamento múltiplo de eletroferogramas (nas direções direto e reverso) com uma sequência de referência. Assim, pode-se fazer uma análise minuciosa de cada pico gerado pelo ABI 3130.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Este estudo fez uso de algumas análises estatísticas: teste qui-quadrado (X2) para avaliar se frequências dos polimorfismos dos grupos controle e patológico estavam em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) e teste (t) de Student de distribuição bicauldal com variação desigual de duas amostras para avaliar se houve diferenças estatísticas significativas entre as frequencias do polimorfismo do GHR nestes dois grupos populacionais.
4.5.1 Qui-quadrado (X2)
O qui-quadrado determina se os valores observados se desviam do valor esperado, caso as duas variáveis não estivessem correlacionadas. O nível de significância de 5% para 1 grau de liberdade é 3,84 (utilizado nas análises deste trabalho) (CALLEGARI-JACQUES, 2003)
Hipótese nula (H0): população está em Equilíbrio de Hardy-Weinberg
Hipótese alternativa (H1): população não está em Equilíbrio de Hardy- Weinberg.
Portanto, para valores de X2< 3,84, aceita-se H0.
4.5.2 Teste (t) de Student
O teste (t) foi utilizado para avaliar diferenças de frequência genotípica entre população controle e população normal. A importância deste teste está na distribuição t de Student. Esta distribuição é criada a partir de variáveis aleatórias que seguem a distribuição normal, quando sua média e variância são desconhecidas. Este teste identifica a probabilidade desta distribuição t de Student ser um evento aleatório ou não. Se esta probabilidade for pequena, pode-se concluir que o resultado observado é estatisticamente relevante (CALLEGARI-JACQUES, 2003).
Esta probabilidade também é conhecida como p-valor. Normalmente este p- valor está atrelado a um grau de confiança previamente estabelecido pelo teste (95%, 98%, 99% etc.) para definir se a hipótese nula deve ser rejeitada. Se o p-valor encontrado for maior que o p-valor tabelado (estabelecido pelo grau de confiança), a hipótese nula é rejeitada (CALLEGARI-JACQUES, 2003).
Hipótese nula (H0): populações com diferenças de frequências do polimorfismo do GHR estatisticamente significativas.
Hipótese alternativa (H1): populações com diferenças de frequências do polimorfismo do GHR sem diferenças estatisticamente significantes.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 PACIENTES
Os pacientes selecionados tiveram uma média de tamanho ao nascimento de 45,14 cm; média de idade no diagnóstico de 8,3 anos; média de estatura no dianóstico de 105, 4 cm (Tabela 7).
Tabela 7: Dados clínicos dos pacientes com BEI
Pac. Sexo DN TN IS ID ED Percentil HF
1 M 23/12/2002 40 cm nascimento 4 meses 53 cm <p3 Não 2 F 25/2/2002 40 cm - 7,5 anos 108,5 cm <p3 Não
3 F 11/1/2000 48 cm - 9,8 anos 112 cm <p3 Não
4 F 15/6/2000 45 cm 1 ano 9,2 anos 114,8 cm <p3 Sim
5 M 30/3/2000 46 cm - - - - Sim
6 F 8/9/1999 45 cm 9 meses 9 anos 118 cm p3-10 Não 7 M 20/6/2006 42 cm nascimento 2,5 anos 81 cm <p3 Não
8 M - - - -
9 F 19/10/2005 46,5 cm - 2,7 anos 82,3 cm <p3 Sim 11 F 21/7/2000 40 cm nascimento 8,7 anos 102 cm <p3 Sim 12 M 25/12/1991 PIG - 17,7 anos 153,5 cm <p3 Sim 13 F 7/2/2002 47 cm 4 anos 7 anos 114,2 cm p3< Sim 15 F 2/4/1999 44 cm - 10,5 anos 123,4 cm <p3 Sim 16 M 20/2/1996 52 cm 8m 13,8 anos 146,5 cm <p3 Sim
17 F - - - -
18 F 19/3/1999 47 cm 5 anos 6,9 anos 109 cm <p3 Não
19 F - - - -
20 M - - - -
30 F 18/8/2003 - - - -
31 F - - - -
32 F - - - -
33 F 21/6/1996 47,5 cm 13 anos 13 anos 140 cm <p3 Sim 36 F 3/7/2000 47cm - 10,8 anos 126,5 cm <p3 Sim 37 F 9/11/2000 ? 9 anos 10,4 anos 122 cm <p3 Não 38 F 7/1/2006 44,5 cm - 4,8 anos 96,5 cm <p3 Sim 39 F 7/9/2001 46 cm 7 meses 9,5 anos 112 cm <p3 Sim 40 F 20/1/2010 46 cm nascimento 1,2 anos 66,4 cm <p3 Sim 41 F 14/12/2000 51 cm 8,5 anos 9, 5 anos 116,5 cm <p3 Sim Pac.: paciente; DN: data de nascimento; TN: tamanho no nascimento; IS: Início dos sintomas; ID: idade no diagnóstico; ED: Estatura no diagnóstico; HF: histórico familiar.
Após verificações posteriores de prontuários, alguns indivíduos tiveram que ser eliminados do estudo. Em se tratando deste estudo, isto é admissível, pois por mais que existam conceitos definidos sobre BEI (COHEN et al., 2008), isto não se reflete na prática, sendo, portanto, uma seleção difícil (LIFSHITZ; BOTERO, 2007).
5.2 GENOTIPAGEM GHR
5.2.1 Validação da genotipagem por qPCR
Para validar o uso de genotipagem do SNP rs6873545 por qPCR como substituto para PCR convencional na população brasileira, genotiparam-se 105 indivíduos normais pelas duas técnicas, a primeira por PCR e a segunda por qPCR proposta (GLAD et al.; PANTEL et al., 2000). Em vez de se fazer uma única PCR multiplex, optou-se em realizar duas PCRs separadas, devido problemas de amplificações inespecíficas ou preferenciais.
A genotipagem por PCR foi determinada a partir da presença (ou não) das bandas nos comprimentos esperados (PANTEL et al., 2000). Caso as amostras apresentassem somente um das bandas, estas eram determinadas como homozigotas (fl/fl ou d3/d3), porém se elas apresentassem as duas bandas, eram genotipadas como heterozigotas (fl/d3) (Figura 12).
Figura 12: Discriminação alélica do polimorfismo do GHR por PCR
Genotipagem por PCR realizada de acordo com Pantel et al. modificado (PANTEL et al., 2000). Referência para o tamanho das bandas: Kb plus DNA Ladder. As bandas de interesse se localizam logo acima da linha vermelha. Na parte superior é possível identificar bandas com aproximadamente 532 pb, indicando a presença do alelo GHRd3. Na parte inferior é possível identificar bandas com aproximadamente 935 pb, indicando a presença do alelo GHRfl.
A genotipagem por qPCR foi discriminada por um gráfico gerado pelo Software Detection System (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) onde fl/fl (azul), fl/d3 (verde) e d3/d3 (vermelho) (Figura 13) (GLAD et al.)
Figura 13: Discriminação alélica do polimorfismo do GHR por qPCR.
O gráfico mostra a intensidade dos sinais das fluorescencias FAM e VIC para cada amostra. O eixo y (ordenadas) indica a intensidade da fluorescência FAM, relativa ao aleloGHRfl, enquanto o eixo x (abscissas) indica a intensidade da fluorescência VIC, relativa ao aleloGHRd3. A discriminação genotípica é feita de acordo com as cores plotadas pelo software: fl/fl (T/T; azul), fl/d3 (T/C; verde) and d3/d3 (C/C; vermelho).
A genotipagem da população brasileira (BRA) a partir do taqSNP rs6873545 para inferir os genótpios GHRd3 e GHRfl foi feita em amostras já validadas como amostra representativa para desta população (LINS et al., 2010). O resultado apontou congruência de 100% para todas as 105 amostras testadas. Este resultado validou a hipótese por causa do desequilíbrio de ligação existente entre o SNP rs6873545 e o polimorfismo, sendo, portanto uma alternativa para genotipagem do polimorfismo de exon 3 do GHR.
A frequencia alélica foi de 0,276 para o alelo GHRd3 e 0,724 para o GHRfl (resultados completos nos Apêndices). Já a frequência genotípica foi de fl/fl 54,3%, fl/d3 36,2% e d3/d3 9,5% (Tabela 8), sem desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (X2= 0.9441; n=105).
Tabela 8: Frequência genotípica e e alélica do polimorfismo do GHR na BRA.
Genótipo/Alelo Indivíduos Frequência
fl/fl 57 54,3%
fl/d3 38 36,2%
d3/d3 10 9,5%
f(GHRd3) - 0,276
A análise do polimorfismo GHR d3/fl é de grande interesse para diversas pesquisas, pois sugere uma influência da sensibilidade ao GH e pode estar relacionado a previsões de resposta para pessoas GHD, no que diz respeito a diversos fenótipos, tais como altura, obesidade, resistência a insulina, intolerância a glicose, aumento de ácidos graxos séricos, esteatose hepática entre outros (AUDI et al., 2006; FAN et al., 2009; GLAD et al.). Por isso, a execução da genotipagem, por um método confiável e simples, é muito importante para estes tipos de estudos.
Quando se comparou as duas técnicas, percebeu-se várias vantagens da qPCR sobre a PCR: enquanto a padronização da PCR levou mais de 2 meses sem sucesso, a qPCR foi otimizada para usar metade dos volumes dos reagentes; o tempo de execução foi 80% menor, devido principalmente ao grande número de repetições de PCR (32%); a qPCR se mostrou mais sensível (4 amostras que não haviam sido genotipadas por PCR, foram genotipadas por qPCR); utilizou uma quantidade menor de DNA; e não fez uso do brometo de etídio, substância cancerígena.
Por outro lado, os custos dos reagentes e equipamento da genotipagem por qPCR são superiores, mas se considerar a mão-de-obra e as repetições por PCR, estes valores tendem a se equilibrar (GLAD et al., 2010). Dentro de um laboratório de serviço diagnóstico, estes parâmetros devem ser levados em consideração para a escolha da técnica standard de genotipagem.