Os estudos sobre CNVs possibilita hipotetizar que os nucleotídeos presentes em suas regiões estão mais suscetíveis a variações (polimórficas ou não) que nucleotídeos fora destas regiões, com uma diferença entre 1.000 e 10.000 vezes (LUPSKI, 2007; STANKIEWICZ; LUPSKI, 2010). Portanto, o genoma humano é bem mais variável do que se pensava e os CNVs são os grandes responsáveis pela evolução e diversidade genética entre inidivíduos. (STANKIEWICZ; LUPSKI, 2010). Dessa forma, estudos adicionais poderão auxiliar significativamente no esclarecimento da herança de outras doenças.
Os CNVs na região do gene são essenciais para a estratégia de screening (DEN DUNNEN; WHITE, 2006). A região do SHOX, que responde por 500 Kb downstream do gene é composta por sequências específicas que estão diretamente relacionadas à sua expressão. Dentre as várias técnicas conhecidas para identificar estas regiões regulatórias no SHOX, podemos citar algumas: Fluorescent in situ hybridization (FISH), Análise de Microssatélite e Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA). Quando se comparam estas técnicas entre si, percebe-se uma grande vantagem do MLPA sobre as demais.
O FISH não permite a detecção de pequenas deleções em virtude do tamanho das sondas utilizadas, além disso, é uma técnica extremamente laboriosa e de alto custo. Já a Análise de Microssatélite, apesar de muito utilizada, não detecta mutações de ponto e deleções fora da região dos microssatélites. Assim como FISH, também não identifica deleções intragênicas (FUNARI et al., 2008). O surgimento do MLPA alargou as possibilidades de se realizarem estudos de CNV na região do SHOX (e outros genes). Ela permite identificar duplicações ou deleções de maneira simples e rápida, além de apresentar uma resolução maior que as outras técnicas citadas.
Para compreender o seu funcionamento, é necessário primeiro entender como as suas sondas são desenhadas. Elas são oligonucleotídeos de DNA divididas em 3 elementos: sequência dos primers; sequência stuffer; e sequência de anelamento (Figura 8). A sequência de anelamento determina a região com a qual a sonda vai se hibridizar, sendo única para cada sonda. Já nas sequências stuffer pouco importa a sequência em si, sendo relevante apenas o seu tamanho. Ela é variável de uma sonda para outra e tem como objetivo diferenciar os fragmentos pelo número de bases durante a eletroforese do sequenciador. Este mecanismo é importante para o perfeito funcionamento de uma eletroforese com mais de 50 produtos distintos. Enquanto a sequência de primers é exatamente a mesma em todas as sondas, pois na última etapa é feita uma PCR multiplex por um único par de primers complementares a estas duas sequências.
Figura 8: Estrutura de um par de sondas do MLPA.
Primer PCR (preto): sequência de anelamento dos primers, igual em todas as sondas do kit; Sequência Stuffer (vermelho): sequência com a função de deixar os fragmentos com diferentes tamanhos para serem distinguidos e identificados na eletroforese do sequenciador; e Sequência de anelamento (azul): sequência
complementar a região a ser investidagada, específica de cada sonda. Cada par de sonda se hibridiza com uma distância de 1 base, com isso, apenas as sondas que sofrerem a reação da ligase é que amplificam.
O MLPA se fundamenta na hibridização adjacente de pares de sondas, seguida por sua ligação e amplificação. O primeiro passo da técnica é promover a hibridização dos pares de sondas ao DNA (cada sonda dista uma base do seu respectivo par). A próxima etapa constitui-se da ligação dessas sondas, assim, somente quando os pares de oligonucleotídeos estão hibridizados lado a lado é que podem ser unidos pela reação da ligase e, em seguida, amplificados por um par de primers universal, já que a extremidade de todas as sondas possui a mesma sequência nucleotídica.
Após esta PCR, multiplex são gerados vários fragmentos, que são diferenciados pelo comprimento da sequência stuffer. Dessa forma, é possível
distingui-las através de uma eletroforese capilar, comparando o padrão de picos obtidos e os resultados das amostras de referência. O nível de amplificação é proporcional à quantidade de cópias do fragmento, e como cada primer possui um fluoróforo, é possível avaliar pela intensidade do sinal da fluorescência se aquela região investigada pela sonda está duplicada, triplicada ou mesmo deletada (Figura 9).
Figura 9: Esquema da técnica MLPA.
Fonte: MRC Holland.
Após a hibridização das sondas com a sequência alvo, os oligonucleotídeos são enzimaticamente ligados. Cada sonda contém uma sequênciastuffer de
comprimento variável. Estes produtos são amplificados por PCR e distinguidos por eletroforese capilar e por fim, os sinais capturados são interpretados de acordo com seus picos.
Por isso, técnica do MLPA foi escolhida para compor esta pesquisa no que diz respeito à investigação de CNVs. Ela é relativamente nova e possui poucos trabalhos publicados no Brasil. O grande sucesso desta técnica está em sua execução, que apesar de buscar por CNVs, necessita apenas de um termociclador e um sequenciador (o que as difere das demais, que necessitam de uma grande estrutura laboratorial).
Ressalta-se que um dos pontos de maior importância desta pesquisa foi o emprego do MLPA, que sem dúvida terá muito a somar nas próximas pesquisas envolvendo diagnóstico molecular e, o seu uso será expandido aos laboratórios comerciais como ferramenta diagnóstica, como por exemplo, no Instituto Hermes Pardini.
2 JUSTIFICATIVA
Dentre os vários distúrbios relacionados ao esqueleto, patologias que causam baixa estatura merecem um destaque especial por serem motivo de preocupação constante em consultórios pediátricos e possuírem uma incidência média alta (3/100) (RAPPOLD, G. et al., 2007), sendo uma das alterações mais frequentes da infância. Assim, avaliar previsões para estatura sempre foi motivo de preocupação aos pais. O diagnóstico precoce é importantíssimo nestes casos, a fim de propor ao paciente o tratamento correto, visando à melhoria de sua qualidade de vida, tanto nos aspectos fisiológicos quanto nos aspectos sociais.
Para isso, é imprescindível a criação de um serviço diagnóstico genético- molecular no Distrito Federal (DF). Desta forma seria possível identificar mutações genéticas (não somente para doenças do esqueleto) na população do DF, bem como estimar suas frequências e, inclusive, propor o tratamento mais adequado. Futuramente, estatísticas geradas por este centro, poderiam servir como indicadores para investimentos mais direcionados à Saúde nesta região. Isto teria um impacto direto na qualidade de vida desta população.
Para isso, faz-se necessário o uso de projetos-pilotos, que visam estabelecer e padronizar técnicas diagnósticas, avaliar suas capacidades de identificar mutações ao longo do genoma e, posteriormente, estimar a frequência de seus achados para cada grupo de doenças, com o intuito de avaliá-las se deverão (ou não) ser incorporadas ao serviço de diagnóstico.
Em BEI, a literatura tem evidenciado que mutações de ponto nos genes GHR e SHOX são seus maiores responsáveis (em média, 5%) (BINDER, 2011; BONIOLI et al., 2005; JORGE et al., 2007; KANT; WIT; BREUNING, 2003). Além disso, já existem evidências de pacientes com BEI e variações de CNV em regiões regulatórias próximas ao gene SHOX. A frequência deste último tipo de mutação não é conhecida, tampouco a frequência dos diferentes tipos de mutações em pacientes com BEI na região Centro-Oeste.
Os resultados deste projeto irão constituir um banco de amostras e dados que serão usados em estudos futuros, como alvo de identificação de novas áreas do genoma associados à estatura e, principalmente, como projeto-piloto de um novo serviço diagnóstico genético-molecular no Distrito Federal.
Somado a isso, estas informações poderão servir de subsídio para mudanças no protocolo do Ministério da Saúde quanto à disponibilização de tratamento gratuito para pessoas com baixa estatura, visando duas alterações básicas: inclusão dos pacientes com BEI como possíveis beneficiários ao tratamento com GH ou IGF-1, bem como a inserção de critérios moleculares no diagnóstico desta patologia.
A exemplo da FDA e EMEA, a inserção dos critérios moleculares poderá complementar o fechamento do diagnóstico e conduta terapêutica, já que a escolha do tratamento depende da origem da doença. Aliado a isso, a dosagem terapêutica com rhGH também poderá ser prevista, pois vários estudos têm mostrado diferentes respostas dos alelos GHRfl e GHRd3 em terapias com rhGH (DOS SANTOS et al., 2004; JORGE et al., 2006; TOYOSHIMA et al., 2007; WASSENAAR et al., 2009).
3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar alterações nos genes SHOX e GHR em pessoas com Baixa Estatura Idiopática no Distrito Federal.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Buscar alterações de CNVs no gene SHOX utilizando a técnica do MLPA;
Pesquisar mutações de ponto nos genes SHOX e GHR pela técnica de sequenciamento do tipo Sanger;
Genotipar o polimorfismo do gene GHR por PCR na população brasileira (n>100);
Validar o uso do SNP rs6873545 por PCR quantitativa (qPCR) como substituto da técnica de PCR para inferir os genótipos do polimorfismo do GHR; e
Genotipar o GHR dos indivíduos com Baixa Estatura Idiopática; e
Comparar as frequências genotípicas e alélicas entre as populações de Baixa estatura idiopática e a população brasileira.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Esta pesquisa faz parte do projeto ‘Investigação de alterações gênicas como guia em tratamento de pessoas com baixa estatura idiopática no DF’ cujo protocolo 248/2009 foi submetido à apreciação pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UCB no dia 15 de julho de 2009 e aprovado em sua 87ª reunião, no dia 17 de agosto de 2009 conforme as diretrizes descritas no Ofício de n° 248/2009 e com parecer consubstanciado N.° CEP/UCB 111/2009 (Anexo C).
4.1 CASUÍSTICA
Trinta e dois pacientes foram pré-selecionados pelo Serviço de Genética Clínica da Secretaria de Saúde do DF (NuGen), com estatura (proporcional) abaixo do 3° percentil para idade, sexo e população, com análise cromossômica normal e avaliação clínica-radiológica que não sugira osteodisplasia ou outra síndrome genética reconhecível, relacionada ao SHOX ou GHR. Destes, quatro foram eliminados: três por possuírem hipotiroidismo e outro por ter sido diagnosticado com deficiência de IGF-1.
Em um total de vinte e oito pacientes, sete eram do sexo masculino e vinte e um eram do sexo feminino. Esta diferença refletiu o vício da captação preferencial por mulheres, pois o NuGen é um centro de referência em diagnóstico de Síndrome de Turner para o DF. Todos os pacientes e seus representantes legais foram informados sobre a pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo B).
4.2 COLETA DE AMOSTRAS
O material biológico de escolha para esta pesquisa foi sangue periférico. Fez- se as coletas a vácuo em dois tubos de plástico ‘inquebráveis’ de volume de 4 mL contendo como anticoagulante o EDTA K3. Imediatamente após a coleta, resfriaram- se os materiais a 4 °C. Usou-se metade para extração imediata de DNA e a outra metade armazenada a - 80 °C para estudos futuros.
4.3 TÉCNICAS MOLECULARES