Para investigar o gene SHOX, utilizou-se o kit SALA MLPA P018-E1 fornecido por MRC-Holland (MRC Holland, Amsterdam, Holanda). Este kit contém um par de sondas para cada éxon do gene SHOX, bem como um par de sondas adjacente a sua região promotora e vários outros pares para as regiões downstream do SHOX, que é responsável pela regulação de sua transcrição (CHEN et al., 2009). Além disso, existem sondas nos braços curto e longo do cromossomo X que podem ser
utilizados para caracterizar grandes deleções - capazes de diferenciar deleções no SHOX de um cariótipo de Síndrome de Turner. O kit possui um total de 53 pares de sondas com amplificações entre 64 e 490 pares de base:
10 sondas controles 10 sondas referências
7 sondas nos éxons do gene SHOX; 1 sonda intrônica entre os éxons 6a e 6b.
1 sonda upstream do gene, na região promotora; 13 sondas downstream do gene associado com BEI; e 11 sondas em genes presente no cromossomo X.
As sondas de controle dokit foram desenhadas para fazerem a verificação de sexo, qualidade e quantidade de DNA, parâmetros indispensáveis para uma boa análise:
4 sondas DNA Quantity fragmentes (fragmentos Q);
3 sondas DNA denaturation control fragments (fragmentos D); 1 sonda controle de fragmento X; e
2 sondas controles de fragmentos Y.
Abaixo, observa-se de forma mais detalhada os nomes das sondas, e seus respectivos tamanhos e posições em relação ao SHOX (Tabela 6).
Tabela 6: Sondas utilizadas pelo Kit MLPA P018-E1. Tamanho
(nt) Salsa MLPA probe Gene/éxon Seq. Parcial próximo à hibridização
64-70-76-82 Q-fragments: DNA quantity - -
88-92-96 D-fragments: indica desnaturação incompleta - -
100 X-fragment: específica para o cromossomo X - -
105 Y-fragment: específica para o cromossomo Y - -
118 Y-fragment: específica para o cromossomo Y - -
130 Referenceprobe 00797-L00463 5q31 - -
136 SHOX-areaprobe 05642-L05096 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 GCAGCAGTGAAA-GTGAGCATTCCC
142 IL3RA probe 13597-L15055 Xp22.33-PAR1 IL3RA gene TGCACAGATAAG-TTTGTCGTCTTT
148 SHOX-areaprobe 05648-L06218 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TGGTGCTGAAAT-GAGGAAGCCCTG
154 SHOX-areaprobe 13821-L14642 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 GATGGCTGATAA-TTACTCCGTATG
160 Referenceprobe 04966-L04696 1p22 - -
166 166 SHOXprobe 01145-L00702 Éxon 1 PAR1 SHOX éxon 1 TTTCTACTGCAA-ACAGAAATGGGA
172 SHOX-areaprobe 05643-L15705 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 ACACCACCAGAGT-TACTTGAATCAA
178 SHOX-areaprobe 05649-L15335 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TGAGGAGGTACC-TCAAAGCTAAAC
184 SHOX-areaprobe 06293-L06219 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TAATTGATGAGA-TGCAGAAGCCAG
191 Referenceprobe 06057-L06042 4p16 - -
198 SHOX-areaprobe 13296-L15336 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 GGAAAACCACGT-TCCTATCGATCC
204 SHOXprobe 01146-L06220 Éxon 2 PAR1 SHOX éxon 2 ACCACGTAGACA-ATGACAAGGAGA
211 PPP2R3B probe 09333-L10292 Xp22.33-PAR1 PPP2R3B gene CGTCCGAGTTCC-ACTCGCGCTACA
219 Referenceprobe 03247-L02684 13q14 - -
226 SHOXprobe 09336-L00708 Intron 6 PAR1 SHOX intron 6 TGGCTTCACGAG-TTCAGCCCATTG
231 SHOXprobe 09337-L00911 Éxon 6 (6a) PAR1 SHOX éxon 6 (6a) AAGCAACAGCAA-GAATTCCAGCAT
238 KAL1 probe 06402-L09795 Xp22.31 Xp22.31 GTTTCCTGAAGC-GTGTGCCCACAA
245 SHOXprobe 01147-L00802 Éxon 3 PAR1 SHOX éxon 3 CGGGCAGACCAA-GCTGAAACAGAG
Tabela 6: Sondas utilizadas pelo Kit MLPA P018-E1 (continuação). 265
LOC159015 probe 01341-L06221 4 kb before SHOX-
PAR1 SHOX region LOC159015 GCCTGGAACAGA-ACTTCCGCGGGG
274 FANCB probe 03906-L03066 Xp22.2 Xp22.2 TATTGGTCTTGT-GGACAGTAGTTT
283 NLGN4X probe 05587-L04577 Xp22.32 NLGN4X gene GACGGCTTGGGT-GATGCACGAAAT
290 SHOX-areaprobe 06291-L06222 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 CTTGAAAGGGCA-GGAACTCTAATT
300 SHOXprobe 01148-L15501 Éxon 4 PAR1 SHOX éxon 4 CAGAACCGGAGA-GCCAAGTGCCGC
310 ASMT probe 01153-L00712 Xp22.33-PAR1 ASMT gene GACATCCCAGAA-GTGGTGTGGACG
318 SHOX-areaprobe 05645-L05099 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TGTTCCCACCGT-AAAACTCACTCC
328 GPR143 (OA1) probe 02566-L10170 Xp22.2 Xp22.2 GGGCGCTGGAGT-CCCAACTTACCT
335 SHOXprobe 01149-L00910 Éxon 5 PAR1 SHOX éxon 5 ACAGCCAACCAC-CTAGACGCCTGC
346 Referenceprobe 06560-L06118 1q32 - -
355 VAMP7 (SYBL1) probe 01156-L00659 Xq28-PAR2 Xq28 TGTGGGAAAAGT-GTTTCCATTCTG
364 Referenceprobe 01838-L01403 16p13 - -
370 SHOX-areaprobe 14697-L16348 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 CTCTGGTGAGAT-GCCATCTAGAGA
386 CSF2RA probe 10251-L15502 Xp22.33-PAR1 CSF2RA gene GACAAGCCTTCT-GCTCTGTGAGTT
392 SHOX probe 09338-L15503 1.4 kb before éxon 7 (6b) SHOXéxon 7 (7b) TCCCACATTCTT-GGAATCACAATG
400 CRLF2 probe 13911-L16505 Xp22.33-PAR1 CRLF2 gene GAATGCCAGCAA-ATACTCCAGGAC
412 Referenceprobe 09793-L12593 15q21 - -
420 AIFM1 (PDCD8) probe 00820-L15506 Xq25 AIFM1 gene TATTGGTCTTGT-GGACAGTAGTTT
432 SHOX-areaprobe 05646-L15507 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TGCATGTCTGCT-TTTTGAATGGCC
439 SHOX-areaprobe 09335-L15508 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 GAAATTCAGTTT-TAATAACACAGA
463 SHOX-areaprobe 13297-L15510 Xp22.33-PAR1 Xp22.32-PAR1 TACAGCAAATGA-TACGTATAAATT
474 Referenceprobe 09888-L10301 16p13 - -
490 Referenceprobe 12463-L13464 9q31 - -
Fonte: MRC Holland.
Tabela fornece o tamanho em nucleotídeos (nt) de cada produto da amplificação multtiplex, o nome das sondas o local de hibridização de cada um delas, bem como a sequência parcial de regiões próximas ao local de anelamento dos primers. A sequência intrônica, localizada entre os éxons 6a e 6b, foi nomeada de éxon 7 pelo kit
Para executar a técnica do MLPA, foram necessários inicialmente entre 50 e 200 ng de DNA diluídos num volume 5 µL de tampão TE. Após a seleção das amostras, teve-se o cuidado de selecionar os controles de forma adequada e de acordo com a seguinte determinação: uso de pelo menos 3 amostras de referência em cada corrida. Em caso de mais de 21 amostras, adicionou-se uma de referência para cada sete novas amostras.
O primeiro dia da técnica consistiu em promover a desnaturação completa do DNA. Para tal, colocaram-se as amostras no termociclador Veriti (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), incubou-as por 1 minuto a 95 °C. Em seguida, adicionou-se 3,0 μL do hibridization mastermix (1,5 μL de probemix; e 1,5 μL de buffer MLPA) em cada amostra, seguido por incubação durante 18 horas a 60 °C para hibridação das sondas.
O segundo dia se inciou com a retirada das amostras e adição de 32 μL do ligase mastermix (3,0μL Ligase buffer; 3,0 μL Ligase buffer B; 1,0 μL Ligase; e 25,0 μl dH2O) para cada amostra à temperatura de 54 °C, seguidos por 5 minutos a 98 °C para ativação térmica da enzima Ligase para que os pares de sondas adjacentes pudessem se ligar.
Com as amostras em 15 °C, o próximo passo foi a execução da PCR propriamente dita. Para isso, preparou-se buffer mastermix (4,0 μL SALSA buffer PCR; e 26,0 μL de dH2O). Em seguida, adicionou-se 30 µL deste mix em cada novo tubo previamente identificado. À temperatura ambiente, transferiu-se 10 μL das amostras (hibridizadas) para os seus respectivos tubos. Em seguida, preparou-se o polymerase mastermix (2,0 μL SALA PCR-primers; 2,0 μL SALA Buffer enzime dilution; 5,5 μL denaturation buffer; e 0,5 μL SALSA polymerase). Adicionou-se 10 µL de polymerase mastermix em cada tubo previamente aquecido no termociclador a 60 °C. A partir daí, seguiu-se o programa de PCR de acordo com as instruções:
Desnaturação inicial: 95 °C por 30 seg; Desnaturação: 95 °C por 30 seg.; Anelamento: 60 °C por 1 30 seg; Extensão: 72 °C por 1 min.;
(repetir 35 vezes as etapas 2 a 4) 72 °C por 20 min; 15 °C ∞
Após esta etapa, ressupendeu-se e desnaturou-se as amostras com HiDi (Formamida) e size standard LIZ-500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Este último reagente permite a identificação dos fragmentos separados no sequenciador ABI 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As condições de injeção obedeceram ao seguinte protocolo: voltagem de 1,6 KV; tempo de injeção 15 seg; voltagem de corrida: 15 KV; polímero: POP7.