General discussion of cuttings piles

O DNA (ácido desoxirribonucléico) e o RNA (ácido ribonucléico) são for- mados pelo encadeamento linear de nucleotídeos, levando informações que podem ser transmitidas de uma geração para a seguinte. Os nucleotídeos são compostos por uma base nitrogenada, um radical fosfato e um açúcar (desoxirribose ou ribose). No DNA, cada nucleotídeo pode apresentar uma de quatro bases possíveis: adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T), ligadas ao carbono-1da desoxirribose. Uma cadeia de DNA é composta por vários nucleotídeos, ligados covalentemente, com uma seqüência alternada de açúcar e fosfato. Os grupos fosfato estão ligados a hidroxilas das posições 3' e 5' de duas moléculas de desoxirribose através de ligações éster, originando as ligações fosfodiéster1_{. As moléculas de RNA transferem as informações}

genéticas para as proteínas, as “moléculas funcionais” das informações contidas no DNA. Embora apresentem semelhanças, as estruturas do RNA e do DNA possuem diferenças importantes: o RNA é constituído por um único encadeamento de nucleotídeos (fita simples); as bases nitrogenadas presentes no RNA são a adenina (A), citosina (C), guanina (G) e uracila (U), ao invés da timina e; possuem ribose no lugar da desoxirribose.

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1 _{A hidroxila 3’ do açúcar de um determinado nucleotídeo é esterificada a um grupo}

Componentes dos ácidos nucléicos e a estrutura básica de um nucleotídeo.

A relação entre a estrutura de uma biomolécula e a sua função no orga- nismo é um dos princípios básicos da bioquímica e da biologia molecular. Em 25 de abril de 1953, James Watson e Francis Crick publicaram um artigo2 _de

uma única página na revista Nature, determinando a estrutura em “dupla hélice” da molécula do DNA. Watson e Crick propuseram um modelo tridimensional da molécula de DNA em que as duas fitas ficam emparelhadas, unidas internamente por pontes de hidrogênio entre duas bases nitrogenadas, enquanto as desoxirriboses e os fosfatos formam um arcabouço externo. Nessa estrutura a adenina se liga com a timina (A-T) e a guanina com a citosina (G-C), através de ligações de hidrogênio.

O modelo permitiu que fosse inferido como o DNA atua como material genético. A informação genética é armazenada na seqüência de bases nitrogenadas existentes ao longo da cadeia do ácido nucléico. A partir desse momento, em que se consolidava a importância e a função do DNA no armazenamento e na transmissão das características de um ser vivo para os seus descendentes, questões referentes aos processos de duplicação do DNA

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2 _{Molecular Structure of Nucleic Acids. Revista Nature, 25 de abril de 1953 (No. 4356,}

Vol. 171: pág. 737-738).

Adenina Guanina

Timina Citosina Uracila

Bases

Açúcares

Desoxirribose - DNA Ribose - RNA

e do controle da síntese de proteínas alavancaram novas pesquisas, permitindo a grande evolução da genética e da biologia molecular, com a produção de conhecimentos e de tecnologias como a do DNA recombinante.

Moléculas de DNA são construídas a partir das seqüências das suas bases nitrogenadas, onde cada seqüência de bases de um filamento determina a seqüência de um filamento complementar. O modelo em dupla hélice permi- te ao DNA que ele realize um mecanismo de duplicação semiconservativa, sendo fundamental a ação de enzimas denominadas de DNA polimerases. As DNA polimerases sintetizam uma nova fita de DNA através da polimerização de nucleotídeos.

Representação do modelo de Watson e Crick da estrutura em dupla hélice do DNA e a função de cada uma de suas fitas como molde, sobre as quais uma fita nova complemen- tar é produzida (Extraída de Harper: Bioquímica, 9ª Ed. São Paulo. Atheneu Editora, 2002. fig.37-4. p.405).

A expressão gênica ocorre através dos processos de transcrição e tradução. A transcrição consiste na transmissão das informações contidas no DNA para um RNA mensageiro (RNAm), que vai atuar como um molde para a construção

de uma proteína. A tradução consiste na síntese de proteínas de acordo com as instruções existentes nas moléculas de RNAm. Além do RNA mensageiro, outros dois tipos de RNA estão envolvidos na tradução: o RNA transportador (RNAt) e o RNA ribossômico (RNAr).

Os RNAs são sintetizados a partir das instruções do DNA e com a atuação das RNA polimerases (enzimas responsáveis pela síntese de RNA). A fita de DNA que servirá como molde contém regiões chamadas de promotores, se- qüências de bases nitrogenadas que apresentam grande afinidade química com a RNA polimerase, determinando onde deve começar a transcrição. Resumidamente, as funções celulares de cada tipo de RNA são:

a) O RNA mensageiro, ao atuar como intermediário e molde na passa- gem da informação genética do DNA para as proteínas, vai determi- nar a seqüência de aminoácidos que irá formar uma proteína. b) O RNA transportador atua como um “adaptador” no processo de

síntese protéica. Diferentes RNAts reconhecem seletivamente aminoácidos, transportando-os e inserindo-os em locais específicos dos ribossomos; que são as organelas celulares responsáveis pela produção da proteína.

c) O RNA ribossômico é fundamental como matéria-prima na construção dos ribossomos. Os ribossomos possibilitam a interação entre RNAm e RNAt, o que permite a tradução da informação transcrita dos genes (DNA) no RNA, para a construção de uma proteína específica. As proteínas são biomoléculas formadas por aminoácidos que se unem através de ligações covalentes, chamadas de ligações peptídicas. Há 20 tipos de aminoácidos que podem se organizar em diferentes seqüências e núme- ros, conferindo a gigantesca diversidade estrutural e funcional das proteínas. As proteínas também formam canais e sistemas que permitem e controlam a passagem de substâncias entre os meios intra e extracelular, assim como atuam como anticorpos e hormônios.

O código genético é a relação existente entre a seqüência de bases do DNA, dos RNAs que são transcritos, e a seqüência e número de aminoácidos que irão constituir as diferentes proteínas dos organismos vivos. O código genético foi decifrado por volta de 1961 com a participação de Francis Crick.

O código genético determina que cada aminoácido seja codificado por um códon, estrutura formada por uma trinca de bases nitrogenadas do RNA mensageiro. O código genético também é “redundante”, ou em outras pala- vras, determinados aminoácidos são codificados por mais de um códon, visto que existem 64 trincas de bases nitrogenadas para os 20 tipos de aminoácidos que podem entrar na constituição da molécula protéica.

Códons do RNAm não reconhecem e se ligam diretamente aos seus aminoácidos específicos. Para que isso ocorra é fundamental a atuação dos RNAts. Moléculas de RNAt possuem aproximadamente 80 nucleotídeos e uma estrutura tridimensional em forma de folha de trevo em que uma das suas dobraduras apresenta uma trinca de nucleotídeos denominada de anticódon. O anticódon tem a função de reconhecer o códon do RNAm. Em sua outra extremidade o RNAt apresenta uma fita simples de nucleotídeos que é capaz de reconhecer o aminoácido correspondente ao códon do RNAm.

O processo de tradução envolve três etapas, a saber: iniciação, alonga- mento e terminação. Geralmente, a iniciação da síntese protéica ocorre com o códon AUG no RNA mensageiro, que codifica a inserção do aminoácido metionina, que é levado por um RNA transportador com anticódon UAC.

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Proteínas designadas de fatores de iniciação da tradução permitem que ocorra a associação entre o RNAm e o ribossomo.

A fase de alongamento consiste na inserção em seqüência dos aminoácidos para formar a proteína. Nesse processo há três posições fundamentais no complexo formado pelo RNAm e o ribossomo, sendo chamadas de sítio P(peptidil), sítio A (aminoacil) e sítio E (de exit ou saída). A inserção de aminoácidos na cadeia peptídica ocorre em ciclos. Num primeiro momento a cadeia de aminoácidos (cadeia polipeptídica) que está sendo formada é ligada a uma molécula de RNAt, que está ocupando o sítio P. Outro RNAt carregando um aminoácido entra no sítio A e ocorre simultaneamente a união entre esse novo aminoácido na cadeia polipeptídica e a liberação do RNAt do sítio P. O RNAt presente no sítio A fica com a molécula de proteína em formação e migra para o sítio P, enquanto o RNAt que estava no sítio P migra para o sítio E, sendo liberado do complexo RNAm-ribossomo, dando início a um novo ciclo. O processo de terminação também ocorre graças a fatores de terminação que reconhecem um dos códons de terminação (UAA, UAG e UGA). Quando acontece esse reconhecimento, ocorre a liberação da molécula de proteína que foi formada e o desacoplamento do ribossomo do RNA mensageiro.

Representação do processo de tradução (Extraída de David A. Micklos e Greg A. Freyer, A Ciência do DNA, 2a

As proteínas podem sofrer modificação pós-traducional para regular suas atividades nas células ou tecidos. A inserção ou remoção de grupamentos químicos permite o endereçamento da proteína dentro do ambiente celular. Proteínas enzimáticas, por exemplo, podem sofrer adição de substâncias não protéicas, as coenzimas, para poderem agir na catálise de reações. Em outros casos as atividades de uma enzima são reguladas pela inserção ou remoção de grupamentos químicos e de resíduos de aminoácidos. Por outro lado, proteínas que são excretadas para atuarem no meio extracelular sofrem alte- rações que possibilitam seu transporte no interior da célula e a sua secreção através da membrana plasmática.

O objetivo desse capítulo não é o de explorarmos a fundo os processos envolvidos com o controle da expressão gênica. Entretanto, pode-se imaginar a alta complexidade dos processos que garantem, por exemplo, que um neurônio humano seja tão diferente de uma célula muscular ou epitelial, embora os três tipos de células possuam o mesmo genoma. A diferenciação celular é resultado da regulação da expressão dos genes, onde há a manuten- ção da seqüência de nucleotídeos do DNA e a diversificação na produção de moléculas de RNA e de proteínas.

O estudo da regulação gênica teve seu início marcado pelos estudos com a bactéria Escherichia coli. No início da década de 60, no Instituto Pasteur em Paris, François Jacob e Jacques Monod propuseram o modelo denominado de operon para explicar o controle da atividade gênica nas células procarióticas. No operon, substâncias específicas, repressores ou indutores, impedem ou induzem a atividade gênica. O operon pode ser considerado como um conjunto de genes: um gene regulador, um gene operador e um ou mais genes estruturais. O gene regulador produz uma proteína, ou repressor, que impede a ação do gene operador que, inativado, impede a transcrição dos genes estruturais. Os genes estruturais são os responsáveis pela estrutura das proteínas que representam a atividade gênica do operon. Por outro lado, a presença de uma substância indutora reage com a repressora, liberando o gene operador.

A regulação dos genes nos eucariotos é mais complexa do que nos procariotos. A regulação da expressão gênica pode ocorrer em diversas eta- pas dos processos de transcrição e tradução. Resumidamente, podemos en- contrar os seguintes mecanismos de controle:

1) Controle transcricional – consiste no controle que ocorre nas formas de “como” e “quando” um gene vai ser transcrito. Nos eucariotos, por exemplo, a RNA polimerase só pode se ligar aos genes promotores se houver a presença de um grupo de proteínas reguladoras, que irão auxiliar a polimerase a ligar-se ao promotor e a iniciar a transcrição. Essas proteínas são chamadas de fatores de transcrição e podem atuar como ativadores ou repressores do processo transcricional.

2) Controle do processamento de RNA – é o controle exercido, ainda no núcleo celular, através dos mecanismos de splicing, ou processamento, do RNA. Nas células eucarióticas os RNA são geralmente transcritos como moléculas maiores que são reduzidas de tamanho pelo splicing, ou seja, por processos de corte e junção do RNA.

O DNA que transcreve o RNAm é formado por seqüências de nucleotídeos denominadas de éxons e íntrons. Éxons são segmentos que serão traduzidos em proteínas e os íntrons são segmentos que não são codificantes e são removidas pelo mecanismo de splicing na formação do RNA mensageiro.

3) Transporte do RNA e controle de localização – seleção dos RNAms que irão migrar do núcleo celular para o citoplasma e a determinação de onde eles vão se localizar no citoplasma.

4) Controle traducional – processo em que há a seleção dos RNAms que serão traduzidos pelos ribossomos.

5) Controle e degradação do RNAm – ocorre pela seleção e desestabilização de moléculas específicas de RNAm.

6) Controle da atividade protéica – ativação, desativação ou degradação seletiva de proteínas já produzidas.

DNA RNAm 1 Proteína Transcrito de RNA Proteína inativa RNAm 2 6 5 4 3 Núcleo Citoplasma RNAm inativo

De posse dessas informações, os cientistas foram tomados por impulsos de manipular o conteúdo genético dos organismos de maneira precisa e programada. Essa vontade levou a descobertas significativas no campo da biotecnologia, inaugurando a era da Engenharia Genética.