Foram desenhadas três construções diferentes, as quais a partir de agora serão caracterizadas como:
1°: Construção contendo uma cauda de histidina-,
pCambia1300·K·EK·6HCp-tioninaII: contém as sequências de nucleotídeos correspondentes a Cp-tionina II, a sequência do peptídeo sinal kappa (K) para direcionamento do peptídeo para o reticulo endoplasmático (RE) e posterior envio para o apoplasto, um sítio de clivagem para a enteroquinase (EK) utilizado para liberação do peptídeo (após purificação) e uma cauda de histidina (6H) para auxiliar na detecção da proteína expressa utilizando Western-blot ou ELISA.
As construções 2 e 3 não possuem moléculas adicionais Essas construções foram idealizadas uma vez que a presença moléculas adicionais, 6H·EK (6H: cauda de histidina e EK: sítio de clivagem enterokinase), podem influenciar na atividade do peptídeo, de modo que possa colocar em questão a capacidade do peptídeo em atuar contra fitopatógenos.
2°: Construção com direcionamento para o reticulo endoplasmático, mas sem retenção no mesmo- pCambia2300·K·CptioninaII: estão presentes nesta segunda construção a sequência de nucleotídeos correspondente a Cp-tionina II e a sequência do peptídeo sinal kappa. Que direcionará o peptídeo para o reticulo, e posteriormente o peptídeo é liberado para o apoplasto.
3°: Construção com direcionamento e retenção no reticulo endoplasmático- pCambia2300·K·CptioninaII·KDEL: esta terceira construção se assemelha a segunda, com a presença das sequências de nucleotídeos correspondentes à Cp-tionina II e ao peptídeo sinal kappa, no entanto ainda há a presença de outro sinal, o Kdel que reterá o peptídeo no RE.
Construção pCambia1300·K·EK·6HCp-tioninaI
Para a montagem da construção foi utilizado o vetor pCambia1300·K·. Este foi digerido com a enzimas SalI e SacI. A digestão foi realizada primeiramente com a
enzima SalI, a 37°C e posteriormente o volume da reação foi dobrado (para ajustar o tampão) e adicionou-se, a enzima SacI. Após 2-3 horas de digestão a 37°C, o volume total da amostra digerida foi aplicado em eletroforese em gel de agarose para posterior purificação do fragmento como anteriormente mencionado, obtendo assim o fragmento/vetor pCambia1300·K····SalI/SacI.
Para a obtenção do fragmento Cp-tioninaII foram utilizadas as mesmas condições mencionadas acima, no entanto, utilizamos o vetor pDonor·K·6H·EK·Cp- tioninaII (descrito no tópico 5.2.1), após a digestão com as enzimas Sall e SacI e confirmação da digestão em gel de agarose, foi purificado e obtido assim o fragmento/inserto 6H·EK·CptioninaII····SalI/SacI.
A reação de ligação dos fragmentos pCambia1300·K····Sal/SacI e 6H·EK·CptioninaII····SalI/SacI utilizando a T4 DNA ligase I, resultou na construção final pCambia·K·6H·EK·CptioninaII (figura 6). Células bacterianas da linhagem XL1-blue (E.coli) foram transformada com o DNA-plasmidial correspondente a esta construção, e após crescimento e realização de uma mini preparação para obtenção do DNA-plasmidial foi digerido com as enzimas HindIII e SacI para confirmar a presença do inserto.
Após a confirmação por digestão e pelo sequenciamento (Macrogen®) Células da linhagem EHA105 de Agrobacterium tumefaciens, foram transformadas por eletroporação com este vetor para iniciar os processos de transformação mediada por Agrobacterium em cultura de tecido.
Figura 6: Representação esquemática do T-DNA do vetor binário pCambia•K•EK•6H•Cp-tioninaII desenvolvido para transformação tabaco . São mostrando as enzimas de restrições utilizadas para a clonagem do fragmento Cp-tionina II, além também do peptídeo sinal Kappa (direciona ao RE) as moléculas 6H: cauda de histidina e EK: Sítio de clivagem da enteroquinase. Essa construção é regulada pelo promotor CaMV35S com um terminador Tnos poly-A. Apresenta o gene hpt que confere resistência a higromicina. Está é a região que será integrada ao genoma da planta após a transformação mediada por Agrobacterium.
Construção pCambia2300·K·CptioninaII
Para obtermos os fragmentos para a construção deste vetor utilizou-se o vetor de síntese pBsk·Cp-tioninaII, para a retirada do fragmento Cp-tioninaII, e o vetor de destino inicialmente foi o pCambia1300·k.
Para obter o fragmento/inserto Cp-tioninaII foi utilizado o vetor de síntese pBS-K·Cp-tioninaII, digerido com a enzima SpeI com o tampão recomendado pelo fornecedor a 37°C. Posteriormente o volume da reação foi ajustado para que a concentração dos reagentes presentes no tampão ficasse apropriado para a digestão com a enzima SalI. A digestão foi confirmada em gel de agarose (0,8%) e o fragmento obtido foi purificado pelo mesmo procedimento já referido. Obtendo assim ao fim o fragmento/inserto Cp-tioninaII····Sal/SpeI.
Utilizando as enzimas de restrição SalI e SpeI, foi obtido fragmento/vetor pCambia·K····SalI/SpeI igualmente descrito acima.
Foi realizado a reação de ligação entre vetor e inserto obtendo ao final o vetor
pCambia·K·Cp-tioninaII (figura 7). Células da linhagem XL1-blue (E.coli) foi
transformado por eletroporação com este vetor e posteriormente foi confirmado a presença do inserto, com uma reação de digestão com HindIII e EcoRI.
Figura 7: Representação esquemática do T-DNA do vetor binário pCambia1300•K•Cp-tioninaII, desenvolvido para transformação de tabacum cassete primário. São mostrando as enzimas de restrições utilizadas para a clonagem do fragmento Cp-tionina II, além também do peptídeo sinal Kappa (direciona ao RE). Essa construção é regulada pelo promotor CaMV35S com um terminador Tnos poly-A. E apresenta o gene hpt que confere resistência a higromicina. Está é a região que será integrada ao genoma da planta após a transformação mediada por Agrobacterium.
O cassete de expressão pCambia·K·Cp-tioninaII contem o promotor CaMV35S, tendo um gene de seleção que confere resistência à higromicina (gene hpt), porém o gene de seleção hpt foi trocado pelo gene nptII, que confere resistência à canamicina. Para isso repetimos a mesma digestão com HindIII e EcoRI (removendo todo o cassete de expressão) após a confirmação da digestão
em gel de agarose (0,8%) o fragmento equivalente a todo o cassete (CaMV35S·K·Cp-tioninaII·Tnos) foi purificado após eletroforese em gel de agarose.
Anteriormente ao processo de ligação do fragmento/inserto ao vetor pCambia2300 (possui gene nptII- confere resistência a canamicina), este foi digerido com as mesmas enzimas HindIII e EcoRI para obtenção das extremidades complementares. Células bacterianas da linhagem Xl1-blue de E. coli foram transformadas por eletroporação com o vetor resultante da ligação dos fragmentos CaMV35S·K·Cp-tioninaII·Tnos····HindIII/EcoRI e pCambia2300····HindIII/EcoRI. A confirmação da presença do inserto no DNA obtido por mini preparação foi realizado usando as mesmas enzimas HindIII/EcoRI, o resultado foi visualizado em gel de agarose sob UV, a construção final resultante após a mudança do gene de resistência está esquematizado na figura 8.
Figura 8: Representação esquemática do T-DNA do vetor binário pCambia1300•K•Cp-tioninaII, desenvolvido para transformação de tabacum cassete FINAL. Após troca do gene de seleção. São mostrando as enzimas de restrições utilizadas para a clonagem do fragmento Cp-tionina II, além também do peptídeo sinal Kappa (direciona ao RE). Essa construção é regulada pelo promotor CaMV35SS com um terminador Tnos. Apresenta o gene nptII que confere resistência a canamicina.
Construção pCambia2300·K·CptioninaII·KDEL
O fragmento da Cp-tioninaII···SalI/SpeI foi preparado como descrito anteriormente com a uma reação usando as enzimas de restrições SalI/SpeI a partir do vetor pBsk·Cp-tioninaII. O vetor pCambia1300 foi digerido com as enzimas Sal e XbaI resultado nas extremidades necessárias para a clonagem, fragmento/vetor pCambia·K···· Kdel SalI/XbaI. Após a reação de ligação, foi obtido o vetor de transformação pCambia·K·Cp-tioninaI· KDEL (figura 9).
Figura 9: Representação esquemática do T-DNA do vetor binário pCambia1300•K•Cp-tioninaII·KDEL, desenvolvido para transformação de tabaco Cassete primário. São mostrando as enzimas de restrições utilizadas para a clonagem do fragmento Cp-tionina II, além também do peptídeo sinal Kappa. Essa construção é regulada pelo promotor CaMV35S com um terminador Tnos poly-A. Apresenta o gene hpt que confere resistência a higromicina. Está é a região que será integrada ao genoma da planta após a transformação mediada por Agrobacterium.
O mesmo procedimento para troca do gene de seleção adotado para a construção anterior foi aplicado nesta também e assim à construção final resultante após a mudança do gene de resistência está esquematizado na figura 10.
Figura 10: Representação esquemática do T-DNA do vetor binário pCambia1300•K•Cp- tioninaII·KDEL desenvolvido para transformação de tabacum cassete FINAL: Após a troca do gene de seleção. São mostrando as enzimas de restrições utilizadas para a clonagem do fragmento Cp- tionina II, além do peptídeo sinal Kappa (direciona ao RE) e KDEL (retenção no RE). Apresenta o gene nptII que confere resistência a canamicina.