Apesar dos ovos obtidos pelo silenciamento de AntgCHS1 não eclodirem, mas apresentarem uma larva viva, se movendo dentro deles, eles foram utilizados para avaliar o silenciamento de AntgCHS1 sobre as larvas neonatas. Nesse experimento os ovos inviáveis foram perfurados para romper a casca do ovo e forçar a eclosão das larvas. As larvas silenciadas provenientes desse processo não se desenvolveram e apresentaram fenótipos com más formações na cápsula cefálica e nas mandíbulas (Figura III-12).
Figura III-12. Efeito do dsRNA de AntgCHS1 sobre larvas neonatas provenientes de insetos adultos microinjetados de A. grandis. A. Larvas provenientes de adultos microinjetados com dsRNA de AntgCHS1; B. detalhe de larva controle, C e D detalhe de larvas de 1º instar com mal formações na cápsula cefálica.
B C D
5 DISCUSSÃO
Até o presente momento, 49 sequências de quitina sintases de 38 espécies de insetos estão disponíveis nos bancos de dados. Destas, 14 são relatadas em artigos e as outras são preditas de projetos de sequenciamento de genomas e transcritomas. Baseado na similaridade de suas sequências de aminoácidos e suas funções, as quitina sintases de insetos são agrupadas em duas classes, a classe A ou tipo I e classe B ou tipo II. As enzimas da classe A são expressas em células da epiderme e células da traquéia, enquanto a expressão das quitina sintases pertencentes a classe B é expressa em células do epitélio intestinal para a síntese de quitina da membrana peritrófica (IBRAHIM et al., 2000; ARAKANE et al., 2005; ZIMOCH et al., 2005; LIANG et al., 2010)
Neste capitulo, é descrito a clonagem e o sequenciamento do cDNA de uma das quitina sintases de A. grandis. As análises filogenéticas e de alinhamento com outras sequências de quitina sintases de inseto mostraram que esta sequência de quitina sintase de A.
grandis pertence à classe I, e, portanto foi nomeada de AntgCHS1. Esta enzima apresentou
maior similaridade com a sequência protéica da quitina sintase 1 do coleóptero modelo T.
castaneum.
AntgCHS1 é predita ser uma proteína integral de membrana com dezesseis alças transmembranas, destas, nove estão no domínio A e sete no domínio C, topologia encontrada em outras quitina sintases de insetos (AMPASALA et al., 2011; MERZENDORFER, 2011). A massa molecular predita para AntgCHS1 é de 178,4 KDa, semelhante a outras quitina sintases de insetos (MERZENDORFER; ZIMOCH, 2003; ARAKANE et al., 2004). A proteína AntgCHS1 contém seis potenciais sítios de O-glicosilação, cinco potenciais sítios de N-glicosilação e 75 sítios potenciais de fosforilação. Ademais, como em outras quitina sintases da classe I, foi identificada uma hélice coiled-coil logo após a região 3-5TMS. A região coiled-coil é atribuída ser uma região de oligomerização entre proteínas (BURKHARD et al., 2001; MELIA et al., 2002; LIANG et al., 2010) e ela também pode estar envolvida na regulação da atividade da quitina sintase da classe I (ZHU et al., 2002).
No presente trabalho foi detectado somente a presença de somente uma cópia do gene AntgCHS1 no genoma de A. grandis. Entretanto, duas bandas de hibridização foram detectadas em estudos de Southern blot nas digestões utilizando as enzimas EcoRI, XbaI e NcoI, a explicação mais provável é a existência de sítios de restrição dentro de das sequências dos introns deste gene (AMPASALA et al., 2011).
A formação da cutícula é um processo crítico para o crescimento do corpo dos insetos, sendo altamente coordenada dentro dos ciclos de ecdises durante o desenvolvimento desses animais. Para acomodar o aumento no tamanho do corpo os insetos estão submetidos a eventos criticamente cronometrados para digerir a cutícula velha e produzir uma nova cutícula (WILSON; CRYAN, 1997; MOUSSIAN et al., 2007). Portanto, faz-se necessário um melhor entendimento dos processos envolvidos no metabolismo de quitina na epiderme de A. grandis como possível estrutura alvo visando o controle deste inseto praga.
O padrão de expressão de AntgCHS1 foi estudado durante todas as fases de desenvolvimento do inseto por PCR em tempo real. Os mais elevados níveis de expressão desta enzima foram detectados durante os estágios de ovo, 3° instar larval e principalmente na fase de pupa, ou seja, estágios em que está sintetizando uma nova cutícula e formando novas traquéias, as quais são necessárias para o crescimento e desenvolvimento do corpo do inseto (ARAKANE et al., 2008).
A síntese de quitina é critica em diferentes períodos durante o desenvolvimento do corpo dos insetos e a sua interrupção ou redução da deposição de quitina resulta em sua morte. Baseados nos resultados de otimização dos experimentos de silenciamento em A.
grandis para o gene AntgCHS2, descritos anteriormente no capitulo I, experimentos de
silenciamento foram realizados para validar funcionalmente AntgCHS1.
As quitina sintases da classe I apresentam uma alta expressão durante a fase de pupa (ARAKANE et al., 2008; MOUSSIAN, 2010). Verificou-se que AntgCHS1 é essencial para a formação da cutícula entre a transição da fase larval para a fase de pupa. Quando dsRNA para AntgCHS1 foi microinjetado em larvas de 3° instar estas larvas foram incapazes de sintetizar uma nova cutícula e de se transformar em pupa, mortalidade total foi observada. Fenótipos semelhantes foram observados em T. castaneum para o gene TcCHS-A (ARAKANE et al., 2008).
Quando o dsRNA AntgCHS1 foi injetado em fêmeas adultas, a oviposição e a sobrevivência foi similar ao tratamento controle, porém a viabilidade dos ovos foi significantemente afetada. Foi observado nos ovos tratados o desenvolvimento normal do embrião, entretanto falharam em romper a casca e eclodir (KENNERDELL; CARTHEW, 2000). Postula-se que a incapacidade das larvas não conseguir romper a casca do ovo seja devido ao enfraquecimento e má formação da mandíbula, embora morfologicamente esta pareça normal. Em D. melanogaster mutações no gene CHS-1, antes denominado kkv, apresentavam embriões desenvolvendo normalmente, mas falhavam em eclodir dos ovos. Quando a membrana vitelínica desses ovos mutantes era perfurada por pressão mecânica, os
embriões apresentavam-se muitas vezes mais esticados do que os embriões selvagens (JURGENS et al., 1984). Este fenótipo, denominado “blimp” pode ser explicado por uma
falha das células epidérmicas em depositar a cutícula corretamente. A perda de função por mutações em quitina sintases, ou a inibição da síntese de quitina, com os inibidores sintéticos benzoil-fenil-uréia, e lufenuron, podem produzir este mesmo fenótipo (WILSON; CRYAN, 1997; OSTROWSKI et al., 2002; GANGISHETTI et al., 2009).
Aqui também descrevemos um novo tipo de experimento para avaliar o silenciamento de quitina sintases da classe I em larvas neonatas. Nesse experimento foi realizada a perfuração da casca do ovo para possibilitar a eclosão das larvas. Assim como postulado anteriormente, os resultados obtidos pelo silenciamento de AntgCHS1 demonstraram que esse gene é essencial para a formação da mandíbula e de uma cápsula cefálica funcionais em A.
grandis. As larvas silenciadas não conseguiram realizar a ecdise, resultando na sua morte.
Assim, a síntese de quitina na epiderme de A. grandis é vital para o seu desenvolvimento e viabilidade da prole. Quando essa via foi inibida por RNAi, fenótipos letais foram observados em diferentes fases de desenvolvimento do inseto. Estes resultados atestam o potencial biotecnológico de AntgCHS1 como alvo essencial para o desenvolvimento de novas estratégias de controle deste inseto que é o mais destruidor das plantações de algodão do Brasil.
6 Conclusão
A quitina sintase da classe A de A. grandis denominada AntgCHS1, é uma enzima transmembrana, e está envolvida na síntese de quitina da cutícula durante as fases de crescimento corporal do inseto;
O silenciamento de AntgCHS1 afetou a viabilidade dos ovos e a formação da cutícula durante o desenvolvimento de A. grandis. Assim, este gene é um candidato potencial para uso no controle, via RNAi, do bicudo-do-algodoeiro.
CAPÍTULO IV – DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS