A cultura do algodão é altamente ameaçada pelo ataque de vários insetos-praga, das quais o bicudo-do-algodoeiro é considerado a praga mais destrutiva da cultura no Brasil. Desde a sua primeira detecção no país, em 1983, no estado de São Paulo (BRAGA SOBRINHO; LUKEFAHR, 1983), o bicudo se alastrou e hoje é encontrado em todas as regiões produtoras do território nacional. Nessas regiões, este inseto encontrou as condições propícias para sua rápida proliferação tais como: elevada oferta de hospedeiro, o algodão, que é cultivado em grandes áreas em sistema de monocultura; temperatura elevadas, clima favorável, e ausência de inimigos naturais. O seu controle por meio de inseticidas é dificultado por seus hábitos endofíticos, onde ficam protegidos dentro do botão floral. Desta maneira a transformação genética do algodoeiro com genes que causem mortalidade ao bicudo é tida como a alternativa mais promissora para conter a população destruidora deste inseto (MORESCO; FUNDO DE APOIO À CULTURA DO ALGODÃO, 2006).
No mundo, a adoção de eventos transgênicos de algodoeiros, carreando toxinas Bt e genes de resistência a herbicida, vem apresentando um impacto significativo positivo no controle de pragas e diminuição dos custos de produção (KATHAGE; QAIM, 2012). Porém, os eventos disponíveis comercialmente conferem resistência a insetos da ordem Lepidoptera, e não tem ação sobre insetos coleópteros.
A suscetibilidade de insetos lepidópteros a toxinas Bt é bem maior do que para insetos coleópteros. Um dos reflexos disso é o número de toxinas ativas contra lepidópteros. Por exemplo, 22 toxinas são ativas para mais de 5 espécies de lepidópteros, enquanto que, somente 2 toxinas foram descritas serem ativas para mais de 5 espécies de coleópteros (VAN FRANKENHUYZEN, 2009). Com relação ao bicudo-do-algodoeiro, somente 4 toxinas foram relatadas na literatura como sendo tóxicas a esse inseto, são elas a Cry1Ba, a Cry1Ia12, a Cry10Aa e a Cry8Ka5 (GROSSI-DE-SA et al., 2007; MARTINS et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2011; AGUIAR et al., 2012). No entanto, as doses efetivas para essas toxinas variam de 5,6 – 610 g/mL, o que é uma concentração muito elevada para fins de aplicação biotecnológica, já que em algodão, os níveis de expressão proteica em eventos transgênicos variam entre 0,2-0,29 g de toxina/g de tecido fresco (TORRES et al., 2006). Portanto, se faz necessária a busca por novos métodos de controle mais potentes que causem letalidade ao
bicudo em níveis compatíveis com a expressão em plantas transgênicas ou que possam ser utilizados em sinergismo com as toxinas Cry.
Dentro desta perspectiva, a partir do ano de 2007, começou a ser relatado na literatura resultados positivos na obtenção de plantas GM resistentes a insetos, baseados na tecnologia do RNAi (BAUM et al., 2007; MAO et al., 2007). Neste contexto, houve então o esforço de se construir um banco de dados de sequências expressas (EST) do bicudo-do-algodoeiro que viesse a fornecer as sequências alvos para o silenciamento gênico. Depois de organizado, com as sequências contidas nesse banco de dados, foi possível mapear várias vias metabólicas essenciais para o desenvolvimento do bicudo.
Dentre as rotas metabólicas identificadas, a via de síntese da quitina é tida como um alvo potencial. A inibição da atividade desta via é um dos principais objetivos para o desenvolvimento de inseticidas, desde a década de 70 (VERLOOP; FERRELL C, 1977). Assim, um melhor conhecimento dos aspectos moleculares da síntese de quitina em A.
grandis pode fornecer a base biológica para o desenvolvimento de novos métodos para seu
controle.
Durante o curso da evolução, os insetos fizeram um excelente uso da estabilidade química do polímero de quitina para organizar estruturas extracelulares como a cutícula (o exoesqueleto) e o revestimento do intestino (a membrana peritrófica). Ambas as estruturas capacitaram os insetos a se protegerem do ambiente enquanto permitia o seu crescimento, mobilidade, respiração e comunicação (MUTHUKRISHNAN et al., 2012). Em função de suas importâncias biológicas, diversas pesquisas têm sido feitas para entender o metabolismo dessas quase que impenetráveis barreiras de defesa dos insetos.
A síntese e a deposição de quitina compreendem uma série sequencial de complexas transformações bioquímicas, biofísicas, intracelulares e extracelulares, algumas das quais ainda pouco entendidas (MOUSSIAN et al., 2007). Dentre as enzimas envolvidas na síntese de quitina em insetos, enfoque especial tem sido dado à última etapa da via que é mediada pela enzima quitina sintase (EC 2.4.1.16), a qual catalisa a polimerização da quitina a partir de monômeros ativados de UDP-N-acetilglucosamina (MERZENDORFER, 2011). Os estudos iniciais de sequenciamento e caracterização de quitina sintases foram realizados em
Saccharomyces cerevisiae na década de 80 (KANG et al., 1984; BULAWA et al., 1986),
sendo que a primeira quitina sintase de inseto (D. melanogaster) só foi sequenciada em 1998 (THIREOS, 1998). Desde então, até o presente momento, 49 sequências de 38 espécies de insetos foram obtidas, quer por métodos de clonagem tradicionais (5’/3’ RACE) ou através de projetos de sequenciamento em larga escala de genomas ou transcritomas.
No presente trabalho, descrevemos a identificação e a caracterização de duas sequências de cDNA de quitina sintases de A. grandis, as quais foram denominadas AntgCHS1 e AntgCHS2. Análises de predição in silico indicaram que esses cDNAs codificam 1567 e 1404 resíduos de aminoácidos, respectivamente. Suas sequências de aminoácidos mostram alta similaridade com outras quitina sintases de insetos.
Apesar de em fungos terem sido encontrados vários parálogos de quitina sintases por espécie (de 2 a 20 genes), cada um desempenhando diferentes funções (RUIZ-HERRERA et al., 2002); em insetos, só se encontrou um ou dois genes por espécie (ARAKANE et al., 2005; WANG et al., 2012; ZHANG et al., 2012). Estes genes estão agrupados em duas grandes classes, classe A e classe B. A divisão das quitina sintases de insetos em duas classes possui relevância funcional, assim como é bem relatada em fungos a especialização funcional de suas quitina sintases. Em insetos, estudos de análise dos padrões de expressão de quitina sintases nos diferentes tecidos mostraram que as enzimas da classe A são expressas na epiderme e células epiteliais das traquéias, mas não no intestino médio (TELLAM et al., 2000; ARAKANE et al., 2004). TcCHS2, um gene de quitina sintase de classe B em T.
castaneum, é expresso, predominantemente durante os períodos em que o inseto se alimenta
ativamente. (ARAKANE et al., 2004). (MARTIN-UDIROZ et al., 2004; KONG et al., 2012). AntgCHS1 e AntgCHS2, inicialmente por alinhamento de suas sequências com a de outros insetos, foram agrupados dentro das classes I e II (ou A e B), respectivamente. Por análise funcional, experimentada por qPCR, esta classificação foi confirmada. Verificou-se que o gene AntgCHS1 é altamente transcrito na epiderme. O estudo do seu padrão de expressão durante o desenvolvimento do inseto revelou que sua expressão estava em sincronismo com as fases de crescimento corporal ou modificação da cutícula (fases de ovo, 3º instar e pupa); enquanto que, os maiores níveis de expressão de AntgCHS2 foram detectados no intestino médio de A. grandis durante as fases de alimentação (larva 3° instar e fase adulta), conforme dados compilados e ilustrados na Figura IV-1. Portanto, este resultado reforça a ideia que genes de quitina sintases da classe A sintetizam a quitina da cutícula, enquanto as da classe B são estão envolvidas na síntese de quitina para a formação membrana peritrófica, assim, desempenhando funções distintas na metamorfose e no comportamento alimentar de insetos (ARAKANE et al., 2008).
Como demonstrado, a síntese de quitina é uma via essencial e ativa durante todo o período de desenvolvimento de A. grandis. Estudos de validação funcional de genes do metabolismo de quitina em T. castaneum mostraram que o silenciamento de enzimas envolvidas na sua síntese, deposição e na sua degradação controlada são alvos viáveis para
causar distúrbios letais (NOH et al., 2012). Assim, distúrbios na síntese de quitina em A.
grandis podem apresentar um grande potencial biotecnológico para o controle desta praga.
Portanto, experimentos de RNAi foram realizados para avaliar funcionalmente as suas duas quitina sintases, identificadas neste trabalho.
Figura IV-1. Padrão de expressão de AntgCHS1 e AntgCHS2em diferentes tecidos de A. grandis. Perfil da expressão tecido especifica de larvas de 3º instar e insetos adultos.
Até o presente momento, não há relatos na literatura de experimentos de silenciamento em A. grandis. Assim, houve a necessidade do desenvolvimento e otimização dos ensaios de silenciamento gênico por microinjeção de dsRNA. Durante o decorrer deste estudo, a sequência de AntgCHS2 foi a primeira a ser obtida e caracterizada, e por isso, ela foi escolhida para iniciar os experimentos de silenciamento.
Assim como nos coleópteros T. castaneum e em D. virgifera foi constatado o efeito de RNAi devido a microinjeção de dsRNA em A. grandis (TOMOYASU et al., 2008; ALVES et al., 2010). Foi verificado por meio dos bioensaios de microinjeção e pelos resultados das análises de PCR em tempo real 1) que a forma mais efetiva de administração é a microinjeção do dsRNA purificado; 2) que dsRNA com tamanho a partir de 180 pb já são capazes de iniciar uma resposta de silenciamento, 3) que não houve diferença entre as regiões escolhidas como alvo para ao silenciamento, quer seja na extremidade 5’, na região central, ou ainda, na extremidade 3’ do cDNA; 4) as concentrações efetivas para desencadear o RNAi diferem com relação ao estágio, adotamos a dose de 200ng por inseto como padrão para os nossos
0 20 40 60 80 100 120 140
Larva - Corpo Larva - Intestino Adulto - Corpo Adulto - Intestino
E xp re ss ão re lat iva (U A ) AntgCHS1 AntgCHS2
experimentos. Essa dose pode variar de gene para gene e do das características do tecido alvo, por exemplo, em C. elegans alguns tecidos são refratários ao RNAi, devido à expressão de uma RNAse (KENNEDY et al., 2004). Todos os resultados gerados destas avaliações de otimização podem servir como parâmetro para novos experimentos de validação funcional em
A. grandis.
A análise funcional dos genes de quitina sintase de A. grandis por silenciamento gênico corroborou com as funções preditas para os dois genes tanto por analise de sequência quanto pelo perfil de expressão. O gene AntgCHS1 quando foi silenciado, dois fenótipos letais foram observados. A enzima AntgCHS1 confirmou ser importante para a síntese da cutícula entre as fases de muda de larva para pupa e a síntese de cutícula das peças bucais e capsula cefálica de embriões, o que não permitia sua eclosão. Já quando o gene AntgCHS2 foi silenciado, a sua expressão do intestino médio de A. grandis foi drasticamente reduzida. Efeitos deletérios decorrentes de uma má absorção de alimentos foram constatados tais como aumento de mortalidade e diminuição de oviposição, indicando o seu papel na síntese de quitina da membrana peritrófica e consequentemente a importância desta estrutura para os mecanismos de digestão dos alimentos neste inseto praga.
Assim como detectado em T. castaneum, aqui observamos o efeito do RNAi larval e do RNAi parental (BUCHER et al., 2002; TOMOYASU; DENELL, 2004). No primeiro, o efeito da microinjeção do dsRNA em larvas persistiu até a fase adulta, como foi demonstrado para o silenciamento de AntgCHS2. No RNAi parental, o efeito do RNAi foi repassada para a prole, como demonstrado para AntgCHS1. Esses dois fatos reforçam a teoria de que em insetos, apesar de não possuírem a enzima RDRP, a qual é responsável pela amplificação da resposta de silenciamento em nematóides e em plantas, existe pelo menos um mecanismo que permite a duração da resposta de RNAi por longos períodos.
Apesar do sucesso obtido em silenciar genes do bicudo-do-algodoeiro por microinjeção, para fins práticos, essa abordagem é obviamente inviável. Estudos enfocando a administração de dsRNA via oral visando o silenciamento gênico estão sendo cada vez mais publicados (HUVENNE; SMAGGHE, 2010). Estudos iniciais de administração de dsRNA em dieta para o bicudo-do-algodoeiro já estão sendo conduzidos por nossa equipe. Como bem relatado por Baum e colaboradores (2008) constatamos também que o bicudo é refratário ao silenciamento pelo dsRNA incorporado em dieta, pois verificamos que o dsRNA é digerido por RNAses presentes no conteúdo intestinal (dados não mostrados). Um estudo recente realizado por Bolognesi e colaboradores (2012), sobre o mecanismo de ação de dsRNAs em
moléculas de dsRNA acima de 70pb. Se em plantas a expressão de um dsRNA longo induz a sua clivagem em moléculas de 21pb, como utilizar a tecnologia do RNAi expresso em plantas de algodoeiro de forma adequada para o controle do bicudo-do-algodoeiro? Assim, algumas lacunas científicas em breve precisarão ser complementadas.
Desta forma, o presente trabalho de pesquisa contribuiu para ampliar os conhecimentos sobre os complexos processos fisiológicos envolvidos na síntese de estruturas quitinosas durante o desenvolvimento corporal de A. grandis sob o ponto de vista molecular, avaliando o papel funcional das quitina sintases e atestando os genes AntgCHS1 e AntgCHS2 como alvos essenciais no desenvolvimento do bicudo-do-algodoeiro, que poderão ser silenciados em estratégias de controle deste inseto-praga.
2 Perspectivas
Realizar estudos por imunohistoquímica da expressão de AntgCHS1 e AntgCHS2 para o melhor entendimento de sua regulação e funcionalidade nos tecidos de A. grandis; Desenvolver e otimizar bioensaios de administração de dsRNA in planta e em dieta
artificial;
Desenvolver metodologias de super-estabilização de moléculas de dsRNA visando sua expressão em plantas de algodão;
Realizar a transformação genética de plantas de algodoeiro contendo dsRNA de AntgCHS1 e de AntgCHS2 visando a obtenção de plantas resistentes ao ataque do bicudo-do-algodoeiro.
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