De forma simplificada, para cada gene, a determinação da função sugerida foi feita por correspondência ao banco de dados não-redundante do National Center
of Biotechnological Information (NCBI) utilizando-se o programa “ORF Finder” e o
Blastp. Os genes identificados foram comparados com genomas de referência e alinhados no programa ClustalW2 (LARKIN, BLACKSHIELDS, et al., 2007).
Os dendogramas filogenéticos foram construídos no programa MEGA 5.0 (TAMURA, PETERSON, et al., 2011) utilizando o modelo de distância p(SAITOU e NEI, 1987). O valor de reamostragem (boostrap) foi de 1000 repetições.
Resultados
O resultado dos screenings nas duas bibliotecas estão resumidas na Tabela 3, seguidas pelas placas dos clones retransformados em cada antibiótico-teste para confirmação dos fenótipos (Figura 8, Figura 9 e Figura 10). A biblioteca de pequenos insertos possui aproximadamente 150.000 clones e a de grandes insertos cerca de 35.000 clones. Assim, o esforço amostral foi de aproximadamente seis vezes para a primeira e de quinze vezes para a última.
Observa-se que, na biblioteca de pequenos insertos, foi confirmado o fenótipo resistente para seis clones em amoxicilina, quatro em carbenicilina, dez em cefoxitina e sete clones em penicilina G. Já na biblioteca de grandes insertos, foi confirmado o fenótipo para dois clones em amoxicilina, cefalexina e penicilina G além de quatro clones em carbenicilina.
Somente foram retransformados aqueles clones que apresentaram fenótipo resistente em meio líquido, previamente à extração dos vetores. Deste modo, nem todos os clones isolados foram retransformados e, por sua vez, nem todos os clones retransformados tiveram fenótipo confirmado.
Tabela 3. Resumo dos clones resistentes isolados da biblioteca de pequenos e grandes insertos.
Clones pCF430 ~ 150.000 clones
~ 8 Kb Cobertura 6X
Clones positivos Extração dos vetores Retransformantes com fenótipo estável Amoxicilina 8 6 6 Carbenicilina 5 5 4 Cefoxitina 15 14 10 Penicilina G 17 7 7 Clones pCC1FOS ~ 65.000 clones ~ 35 Kb Cobertura 15X
Clones positivos Extração dos vetores Retransformantes com fenótipo estável
Amoxicilina 5 2 2
Carbenicilina 8 8 4
Cefalexina 2 2 2
Figura 8. Retransformação dos clones isolados da biblioteca de pequenos insertos em cefoxitina. A) Controle negativo (EPI300+pCF430) e os clones CFX1, CFX2, CFX3 e CFX4. B) Controle negativo (EPI300+pCF430) e os clones CFX5, CFX6, CFX7 e CFX8. C) Controle negativo (EPI300+pCF430) e os clones CFX9, CFX10, CFX12, CFX14 e CFX15. Os clones foram riscados em placa de ágar LB com tetraciclina e cefoxitina, ambos a 20 g/mL e incubados a 37oC, overnight ou até o crescimento de colônias resistentes. Não foram confirmados os fenótipos dos clones CFX1, CFX2 e CFX8.
Figura 9. Retransformação dos clones resistentes isolados da biblioteca de pequenos insertos. A) Clones resistentes a amoxicilina. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCF430), AMX1, AMX2, AMX3, AMX4, AMX6 e AMX7. B) Clones resistentes a carbenicilina. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCF430), CRB1, CRB2, CRB4 e CRB5. C) Clones resistentes a penicilina G. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCF430), PG4, PG5, PG6, PG14, PG15, PG16 e PG17. Todos os clones foram riscados em placas de ágar LB com tetraciclina a 20 g/mL e amoxicilina a 16 g/mL, carbenicilina e penicilina G a 50 g/mL, respectivamente, e incubados a 37oC, overnight ou até o crescimento de colônias resistentes.
Figura 10. Retransformação dos clones resistentes isolados da biblioteca de grandes insertos. A) Clones resistentes a amoxicilina. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+PCC1FOS), AMX2 e AMX3. B) Clones resistentes a carbenicilina. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCC1FOS), CRB1, CRB2, CRB3, CRB4, CRB5 e CRB8. C) Clones resistentes a cefalexina. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCC1FOS), CLX1 e CLX2. D) Clones resistentes a penicilina G. No sentido horário: Controle negativo (EPI300+pCC1FOS), PG1 e PG2. Todos os clones foram riscados em placas de ágar LB com cloranfenicol a 12,5 g/mL e amoxicilina a 16 g/mL, carbenicilina a 25 g/mL, cefalexina a 50 g/mL e penicilina G a 100 g/mL, respectivamente, e incubados a 37oC, overnight ou até o crescimento de colônias resistentes. Não foram confirmados os
fenótipos dos clones CRB3 e CRB4.
Como são muitos os clones resistentes, optou-se por selecionar um clone isolado em cada antibiótico β-lactâmico utilizado nos screenings. Para isso, escolheu-se a biblioteca de pequenos insertos, por carregarem sequências menores de DNA.
Os clones foram selecionados de acordo com o desempenho de crescimento nos antibióticos e tamanho dos insertos (insertos menores foram preferíveis). Ainda, preferiu-se escolher um clone de cada antibiótico selecionado (amoxicilina, cefoxitina, carbenicilina e penicilina G) da biblioteca de pequenos insertos. Assim, AMX3, CFX12, CRB2 e PG17 foram escolhidos para testes subsequentes (Figura 11).
Para avaliar a multirresistência desses clones, plaqueou-se 106 UFC dos clones selecionados em placas contendo o antibiótico de seleção do vetor e os antibióticos-teste. Observou-se que todos os clones são multirresistentes aos β- lactâmicos utilizados no estudo.
A Tabela 4 mostra os dados obtidos neste teste. Percebe-se que o padrão de resistência é diferente para cada clone, o que corrobora com a idéia de que os clones carregam, realmente, insertos diferentes. Ressalta-se que foram considerados resistentes mesmo os clones que cresciam muito pouco em cada antibiótico-teste.
Tabela 4. Teste de multirresistência nos antibióticos β-lactâmicos para os clones selecionados
Clones AMP AMX CFX CFZ CLX CML CRB PG PP Total
AMX3 S R S S R R R S S 4
CFX12 S S R S R R S S S 3
CRB2 S S S S R R R S S 3
PG17 S R R S R S R R S 5
EPI300+pCF430 S S S S S S S S S 0
AMP – ampicilina; AMX – amoxicilina; CFX – cefoxitina; CFZ – ceftazidima; CLX – cefalexina; CML – cefamandol; CRB – carbenicilina; PG – penicilina G; PP – piperacilina; R – resistente; S – sensível
Figura 11. Análise eletroforética em gel de agarose da digestão restritiva com a enzima PstI dos clones selecionados. 1, 4 e 7. DNA ladder 1 Kb Plus (Invitrogen, EUA); 2. AMX3; 3. CFX12; 5. CRB2; 6. PG17; 8. pCF430. Corrida realizada em gel de agarose 0,8% e corado em brometo de etídio. Observam-se as bandas correspondentes ao vetor pCF430 em 10.000 bp. Infere-se o tamanho dos insertos como segue: AMX3 (4,5 Kb), CFX12 (7 Kb), CRB2 (6 Kb) e PG17 (4 Kb).
Entretanto, já que a multirresistência foi avaliada somente dentre os antibióticos utilizados no screening inicial, optou-se por testar a resistência dos clones por outras classes de antibióticos. Este teste foi realizado pela técnica de antibiograma por disco-difusão.
A Figura 12 mostra as placas do teste de susceptibilidade por discos de antibiograma dos clones selecionados e do controle negativo. Observa-se que os clones são sensíveis aos antibióticos selecionados, com exceção à eritromicina e oxacilina.
Entretanto, a eritromicina foi utilizada como controle positivo, já que a EPI300 é resistente a ele. A resistência à oxacilina não foi considerada um resultado significativo, já que o controle positivo não apresenta diferença em relação aos clones metagenômicos.
Figura 12. Teste de susceptibilidade por disco-difusão para os clones selecionados e controle negativo (EPI300+pCF430). A). 1. Amicacina; 2. Amoxicilina + Ácido clavulânico; 3. Aztreonam; 4. Cefepime; 5. Ciprofloxacino; 6. Eritromicina; 7. Gentamicina; 8. Imipenem; 9, Meropenem; 10. Oxacilina; 11. Piperaciclina + Tazobactam; 12. Polimixina B. B) Observa-se a resistência dos clones e controle negativo à eritromicina (disco 6) e à oxacilina (disco 10).
A determinação das concentrações inibitórias mínimas foram realizadas em todos os clones selecionados utilizando os antibióticos para os quais eles mostraram resistência. Observa-se, nos gráficos (Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16 e Figura 17) e Tabela 5, que todos os clones mostram diferença de crescimento e resistência antimicrobiana em relação ao controle negativo, exceto CFX12 e CRB2 em cefamandol. Atribui-se ao fato de que, em meio sólido, estes dois clones crescem muito pouco neste antibiótico. Assim, é esperado que em meio líquido a concentração de inibição seja realmente menor; neste caso, é tão baixa quanto a necessária para inibir o crescimento do controle negativo – a estabilidade fenotípica dos clones neste antibiótico mostrou-se muito variável já que, inicialmente, os clones selecionados cresciam em meio sólido acrescido de cefamandol.
O teste em amoxicilina não mostrou diferença de resistência entre o controle negativo e os clones AMX3 e PG17 – todos cresceram até a última concentração utilizada (512 g/mL). Assim, para testar se a causa era a cepa, os vetores foram
transformados em DH5 – que também não demonstrou diferença entre o controle
negativo e os clones metagenômicos. Atribui-se, novamente, à instabilidade do antibiótico a este fato. Sugere-se novos testes com amoxicilina nova.
Tabela 5. Concentrações Inibitórias Mínimas para os clones selecionados e controle negativo
Clones
Antibiótico EPI300+pCF430 AMX3 CFX12 CRB2 PG17
Amoxicilina - - n/a3 n/a -
Carbenicilina > 4 g/mL > 8 g/mL n/a > 64 g/mL > 16 g/mL Cefalexina > 2 g/mL > 16 g/mL > 8 g/mL > 32 g/mL > 8 g/mL
Cefoxitina > 2 g/mL n/a > 16 g/mL n/a > 16 g/mL Cefamandol >1 g/mL > 2 g/mL > 1 g/mL > 1 g/mL n/a Penicilina G > 8 g/mL n/a n/a n/a > 32 g/mL
Figura 13. Concentração inibitória mínima em carbenicilina. A leitura foi realizada a 595 nm após 16 horas de crescimento a 37 C sob agitação. No eixo x encontram-se as concentrações em g/mL e no eixo y os valores de densidade óptica a 595 nm. O maior valor de desvio padrão foi igual a 0,1.
Figura 14. Concentração inibitória mínima em cefalexina. A leitura foi realizada a 595 nm após 16 horas de crescimento a 37 C sob agitação. No eixo x encontram-se as concentrações em g/mL e no eixo y os valores de densidade óptica a 595 nm. Este é o único antibiótico para o qual todos os clones mostraram algum grau de resistência. O maior valor de desvio padrão foi igual a 0,06.
Figura 15. Concentração inibitória mínima em cefamandol. A leitura foi realizada a 595 nm após 16 horas de crescimento a 37 C sob agitação. No eixo x encontram-se as concentrações em g/mL e no eixo y os valores de densidade óptica a 595 nm. O maior valor de desvio padrão foi igual a 0,13.
Figura 16. Concentração inibitória mínima em cefoxitina. A leitura foi realizada a 595 nm após 16 horas de crescimento a 37 C sob agitação. No eixo x encontram-se as concentrações em g/mL e no eixo y os valores de densidade óptica a 595 nm. O maior valor de desvio padrão foi igual a 0,11.
Figura 17. Concentração inibitória mínima em penicilina G. A leitura foi realizada a 595 nm após 16 horas de crescimento a 37 C sob agitação. No eixo x encontram-se as concentrações em g/mL e no eixo y os valores de densidade óptica a 595 nm. Este foi o único clone que apresentou resistência neste antibiótico. O maior valor de desvio padrão foi igual a 0,14.
A corrida eletroforética da reação de maxiprep dos clones selecionados para sequenciamento está demonstrada na Figura 18. Observa-se que AMX3 e CRB2 precisaram ser concentrados. Após precipitação, os vetores foram quantificados no fluorômetro QubitTM, que resultou na leitura final contida na Tabela 6.
Tabela 6 - Leitura fluorimétrica final dos clones selecionados da biblioteca de pequenos insertos
Clone Concentração (ng/L) AMX3 192 CFX12 220 CRB2 230 PG17 153
Figura 18. Maxiprep dos clones selecionados para sequenciamento. 1 e 11 – DNA ladder 1 Kb Plus (Invitrogen, EUA); 2 e 12 - DNA 100 ng; 3 e 13 - DNA 200 ng; 4 e 14 - DNA 500 ng; 5. AMX3 (1 L); 6. AMX3 (2 L); 7. AMX3 (5 L); 8. CFX12 (1 L); 9. CFX12 (2 L); 10. CFX12 (5 L); 15. CRB2 (1 L); 16. CRB2 (2 L); 17. CRB2 (5 L); 18. PG17 (1 L); 19. PG17 (2 L); 20. PG17 (5 L). Corrida em gel de agarose 0,8% e corado em brometo de etídio.
Para a predição de ORFs em todos os insertos foi utilizado o programa ORF Finder (Open Read Frame Finder) e o Blastp. O resumo das ORFs encontradas e suas descrições estão disponíveis na Tabela 7.
Foram consideradas prováveis ORFs aquelas que apresentaram tamanho compatível com a maioria dos genes bacterianos, ou seja, em torno de 1 Kb.
Observa-se que os scores dos alinhamentos com as sequências do banco de dados do NCBI são, em sua maioria, baixos. Além disso, verifica-se que muitas identidades no banco de dados são proteínas hipotéticas.
As sequências de nucleotídeos completas de todos os insertos metagenômicos selecionados estão discriminadas no Apêndice A. Após edição para retirar bases de baixa qualidade, os insertos apresentaram tamanho total de 4387 bp, 5477 bp, 6522 bp e 4058 bp para AMX3, CFX12, CRB2 e PG17, respectivamente.
As sequências das ORFs não estão mostradas, porém o tamanho em pares de base e aminoácidos estão discriminadas na Tabela 7 para todas as identificadas. Priorizou-se, para a discussão da função das ORFs no fenótipo observado, as que apresentavam domínios conservados, tamanho em torno de 1 Kb e valores de score e e-value próximos dos confiáveis4. Mesmo assim, o valor baixo de score não impede que determinada ORF seja responsável pelo fenótipo resistente e vice- versa.
Os dendogramas filogenéticos foram construídos no programa Mega 5.0 pela metodologia Neihgbor-joining com valor de boostrap de 1000. São mostrados nos dendogramas os agrupamentos de algumas ORFs identificadas nos insertos com sequências caracterizadas das proteínas cuja função foi inferida no Blastp (Figura 19, Figura 20, Figura 21 e Figura 22).
4 Para o score, considerou-se valores confiáveis aqueles acima ou próximos de 300. Para o e-value
não há um valor de referência específico. Entretanto, quanto menor o valor, mais confiável é a inferência de função.
Tabela 7. Prováveis genes identificados nos insertos metagenômicos dos clones AMX3, CFX12, CRB2 e PG17.
AMX3
Besthit Blastp e-value Score Micro-organismo Gene ID Tamanho Cobertura Similaridade Domínios Conservados
ORF1 Hypothetical protein Acid345_1513 [Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345]
2e-43 180 Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345 4069260
238 aa
717 bp 93% 62% AdoMet_MTases superfamily
ORF2 Hypothetical protein Acid345_2576 [Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345] 8e-57 225
Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345 4070539
358 aa
1077 bp 97% 56% Sem domínios conservados
ORF3 Intradiol ring-cleavage dioxygenase [Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345] 1e-118 431
Candidatus Koribacter versatilis
Ellin345 4070538 557 aa 1674 bp 98% 63% CollagenBindB superfamily e Intradiol ring-cleavage dioxygenase superfamily CFX12
ORF1 Two-component hybrid sensor and regulator [Bradyrhizobium japonicum USDA 110] 7e-59 233 Bradyrhizobium japonicum USDA 110 1047960 bll5692 1374 bp 457 aa 55% 48% HATPase c_superfamily HiksA superfamily
ORF2 Methionine synthase [Micromonospora sp.
ATCC 39149] 2e-121 440 Micromonospora sp. ATCC 39149 237886020 1065 bp 354 aa 99% 62% URO-D_CIMS_like superfamily
ORF3 Putative transposase protein [Sinorhizobium
meliloti] 3e-62 241 Sinorhizobium meliloti pSmeSM11ap086 9394979 187 aa 100% 61% Transposase_20 superfamily
ORF4 Putative transposase protein [Sinorhizobium meliloti] 1e-46 189 Sinorhizobium meliloti 6383612 orf92 155 aa 468 bp 81% 71% Transposase_9 superfamily
CRB2
ORF1 Cupin 2 conserved barrel domain protein [Geobacillus sp. Y412MC61] 2e-10 71.2 Geobacillus sp. GYMC_2315 8526180 1068 bp 355 aa 63% 34% Cupin_2 superfamily
ORF2 UDP-N-acetylmuramate--L-alanine ligase [Clostridium perfringens
ATCC 13124] 4.2 36.2
Clostridium perfringens
ATCC 13124 4201340 murC
261 aa
786 bp 48% 26% Sem domínios conservados
ORF3 Hypothetical protein [Dehalococcoides sp.
GT] 1.1 37.4 Dehalococcoides sp. GT
8808534
DehalGT_0085 198 aa 597 bp 42% 30% Sem domínios conservados
ORF4 Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase [Metarhizium acridum CQMa 102] 1.0 37.0 Metarhizium acridum CQMa 102 32269536 171 aa 516 bp 25% 47% Sem domínios conservados
PG17
ORF1 Glutathione S-transferase [Azospirillum sp. B510] 5e-32 142 Azospirillum sp. B510 8791788 gst 223 aa 672 bp 91% 58% GST_C_family superfamilyThioredoxin_like superfamily e
ORF2 [Ktedonobacter racemifer DSM 44963] Transposase IS4 family protein 2e-38 164 Ktedonobacter racemifer DSM 44963 298241044 1077 bp 358 aa 77% 55% DUF772 superfamily
ORF3 ABC transporter peptide-binding protein [Bradyrhizobium japonicum
USDA 110] 6e-176 621
Bradyrhizobium japonicum
USDA 110 1051262 bll0993
488 aa
Figura 19. Dendograma mostrando o agrupamento das sequências de proteína da ORF3 de AMX3, dos dez primeiros hits do Blastp e sequências caracterizadas de proteínas dos grupos de intradiol e extradiol dioxigenases. Os números de acesso estão no início das sequências. Verifica-se o agrupamento externo das sequências de extradiol dioxigenases (BAH90119.1, BAH89443.1, BAH89780.1, BAH90343.1 e BAH89956.1), o que era esperado já que se sabe que essa família de enzimas difere muito das intradiol dioxigenases. Observa-se também a separação das sequências caracterizadas de intradiol dioxigenases (P0036, P00437, O33948, ABM87945.1 e AAK81678.1) em clado diferente das sequências do Blastp e da ORF3, o que evidencia que a ORF identificada é nova.
Figura 20. Dendograma mostrando o agrupamento da ORF1 de CRB2 com os dez primeiros hits no Blastp e sequências caracterizadas de dioxigenases. Foram acrescentadas na análise, ainda, duas sequências adicionais: de uma dioxigenase sem o domínio cupina (AAD29874) e de uma enzima com domínio cupina, mas que não é membro das dioxigenases (BAA17550.1) que são os dois grupos externos na árvore. Observa-se que, analogamente às outras ORFs discutidas aqui, a ORF1 não agrupa com as sequências caracterizadas inseridas na análise. Os números de acesso do NCBI estão representados no começo de cada sequência.
Figura 21. Dendograma mostrando o agrupamento da ORF3 de PG17 com os dez primeiros hits do Blastp e três outras proteínas de referência. O dendograma foi construído no programa MEGA 5.0 com valor de boostrap de 1000 pelo método de Neighbor-Joining. As sequências de Escherichia coli,
Lactococcus lactis e Salmonella enterica foram incluídas na análise para representar bactérias de
origem não ambiental. NCBI accession numbers: Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (NP_767633.1); Thermomicrobium roseum DSM 5159 (YP_00252287.1); Sphaerobacter
thermophilus DSM 20745 (YP_003318939.1); Holdemania filiformis DSM 12042 (ZP_03635359.1); Oligotropha carboxidovorans OM5 (YP_002290491.1); Meiothermus silvanus DSM 4496
(YP_003685944.1); Rhodopseudomonas palustris HaA2 (YP_485270.1); Azospirillum sp. B510 (YP_003451535.1); Clostridium phytofermentans ISDg (YP_001557557.1); Burkholderia ambifaria
MEX-5 (ZP_02907847.1); Escherichia coli str K12 substr. MG1655 (NP_418001.1); Salmonella enterica subsp. enterica serovar Thyphimurium str. LT2 (NP_460705.2) e Lactococcus lactis
Figura 22. Dendograma da ORF1 de PG17 com os dez primeiros hits do Blastp e outras dez sequências representativas das classes bacterianas conhecidas de glutationa S-transferase (beta, chi, teta e zeta). Utilizou-se a metodologia Neighbor-joining e a árvore foi construída no programa Mega 5.0 com valor de boostrap de 1000.
Os alinhamentos múltiplos de todas as ORFs discutidas com as sequências caracterizadas e os hits do Blastp estão discriminados no Apêndice C.
Ainda, foi realizada inferência de estrutura secundária para ORFs identificadas nos insertos dos clones CRB2 (Figura 23) e PG17 (Figura 24). A inferência foi realizada no programa PSIPRED 3.0 (JONES, 1999), disponível em http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.
Figura 23. Representação da estrutura secundária da sequência de gentisato 1,2-dioxigenase de
Silicibacter pomeroyi (PDB ID 3BU7), à esquerda, e da ORF1 de CRB2, à direita. As regiões dos
domínios cupina estão representadas pelos retângulos laranja. Observa-se o padrão característico de configuração de folhas para a formação das estruturas -barril. Verifica-se que as duas proteínas são bicupinas. A predição das estruturas secundárias foi obtida pelo programa PSIPRED v3.0 (JONES, 1999). As folhas estão representadas pelas setas amarelas e as -hélices pelos cilindros cor-de-rosa.
Figura 24. Predição da estrutura secundária da ORF1 de PG17. Observa-se o padrão de estrutura secundária característico das enzimas glutationa S-transferases dado pela presença do módulo na região N-terminal e na predominância de -hélices na C-terminal. As folhas estão representadas pelas setas amarelas e as -hélices pelos cilindros cor-de-rosa. Representação obtida pelo programa PSIPRED v3.0 (JONES, 1999).
Discussão
Este trabalho teve como objetivo identificar clones resistentes a antibióticos β-lactâmicos de duas bibliotecas metagenômicas previamente construídas. Para tal, utilizou-se os antibióticos a seguir: amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cefalexina, cefamandol, cefoxitina, ceftazidima, penicilina G e piperacilina (Sigma Aldrich Ltda, EUA). Isolou-se, no total, sessenta e dois clones, provenientes das bibliotecas metagenômicas de pequenos e grandes insertos.
Após confirmação dos fenótipos, selecionou-se quatro clones da biblioteca de pequenos insertos para testes subsequentes e sequenciamento dos insertos, com o objetivo de identificar os possíveis mecanismos de ação de resistência antimicrobiana de micro-organismos do solo de Cerrado.
Os resultados dos screenings, da multirresistência e das CIMs corroboram com a idéia de que os micro-organismos provenientes do ambiente natural, quando resistentes, o são a baixas concentrações de antibióticos (dado que em concentração mais elevadas – > 100 g/mL – nenhum dos clones é resistente aos antibióticos testados). Este fato era esperado já que estes seres estão menos propensos à pressão seletiva dada pela presença constante de altas concentrações de antibióticos e outros antimicrobianos no meio em que vivem.
Deve-se considerar, entretanto, o gasto energético que a expressão dos insertos causa para as bactérias. Muitas vezes a presença de elementos de resistência – ou até a presença de insertos de DNA grandes – reduzem o fitness dos micro-organismos, o que pode causar diminuição do crescimento da bactéria até sem a presença da pressão antibiótica.
Entretanto, observa-se que nos testes de concentração inibitória mínima em carbenicilina e em cefoxitina (Figura 13 e Figura 16, respectivamente) os clones metagenômicos apresentam valor de OD maior que a EPI300+pCF430, tanto no
controle positivo5 quanto em todas as outras concentrações. Nestes casos,
evidencia-se uma vantagem adaptativa dada pela presença dos insertos.
Ainda, insertos metagenômicos podem carregar genes inteiros ou sequências de genes interrompidas. Assim, o fenótipo pode não ser o ideal porque a proteína codificada não é inteiramente funcional. Este fato pode interferir diretamente no crescimento do micro-organismo em um dado antibiótico, mesmo que ele carregue genes de resistência capazes, teoricamente, de promover crescimento da bactéria em concentrações mais altas de antibióticos.
Além disso, outras limitações inerentes à técnica de metagenoma também devem ser consideradas:
1. a inserção de sequências de DNA cuja origem não é conhecida em um
hospedeiro bacteriano que pode não expressar idealmente a informação –
na verdade sabe-se que a expressão fenotípica real em clones metagenômicos é baixa;
2. a utilização de vetor de clonagem de baixo número de cópias (como é o caso do pCF430) – este fato interfere diretamente na quantidade de transcritos e na identificação dos fenótipos. A quantidade dos produtos gênicos está diretamente ligada ao aumento da resistência a antibióticos; 3. a baixa expressão dos genes nos insertos interfere na identificação dos
fenótipos, além de dificultar muito a estabilidade fenotípica dos clones. Mesmo assim, apesar das limitações acima citadas, a observação de que estes clones são sensíveis a concentrações mais altas de antibióticos (como as utilizadas na clínica) também é condizente com a hipótese de que estes genes de resistência antimicrobiana têm funções diversas nos ambientes naturais. Muitos estudos e autores defendem que a principal está relacionada a mecanismos de sinalização e comunicação entre micro-organismos e comunidades microbianas.
5 No teste de CIM, utilizou-se como controle positivo o crescimento dos clones e controle negativo
Observa-se também que, aparentemente, a resistência está restrita aos