O solo é um ambiente biodiverso, que apresenta comunidade microbiana complexa; provavelmente contém a maior diversidade microbiana de todos os ambientes naturais conhecidos (DANIEL, 2005; DANCE, 2008). Estudos filogenéticos de ecossistemas de solo mostram que o número de espécies
procarióticas encontradas em um grama de solo excede o número de procariotos cultiváveis conhecidos (DANIEL, 2005).
Trata-se de um ambiente muito heterogêneo composto de partículas minerais de diferentes tamanhos, matéria orgânica e grande massa biótica. Os micro-organismos nos solos encontram-se associados à matéria orgânica e podem estar presentes como células isoladas ou em microcolônias (DANIEL, 2004; DANIEL, 2005). A presença de partículas de diferentes tamanhos e composição faz do solo um ambiente muito heterogêneo e capaz de guardar grande diversidade microbiana por disponibilizar diferentes microhabitats.
Bactérias de solo são as principais produtoras de antibióticos e, em seu ambiente, são confrontadas diariamente com diversos tipos de antimicrobianos diferentes; tal fato promove a aquisição ou evolução de elementos de resistência antimicrobiana, tanto em micro-organismos produtores de antibióticos como naqueles não-produtores (RIESENFELD, GOODMAN e HANDELSMAN, 2004). Assim, o solo torna-se um ambiente, ainda subestimado e pouco explorado, rico em genes de resistência antimicrobiana, que já estão presentes ou têm potencial para atingir micro-organismos clinicamente importantes (D´COSTA, MCGRANN, et al., 2006; DANTAS, SOMMER, et al., 2008).
O entendimento do papel ecológico dos antibióticos e dos genes de resistência antimicrobiana no meio ambiente pode auxiliar na previsão e combate à evolução e disseminação dos elementos de resistência bacteriana para o convívio humano (MARTINEZ, 2008). Pode também desenvolver o estudo sobre a função dos antibióticos e dos genes de resistência nas sinalizações entre comunidades microbianas e como essas moléculas agem na interação celular, desmistificando a idéia de que antibióticos e genes de resistência possuem papel exclusivo de combate e defesa dos micro-organismos.
Assim, descrever e identificar os determinantes de resistência no solo ajudará a elucidar novos mecanismos de resistência e prever as frequências com que tais genes são encontrados neste ambiente e que podem ser transferidos para micro-organismos patogênicos (D´COSTA, MCGRANN, et al., 2006).
5. O Bioma Cerrado
O Cerrado é o segundo maior bioma do Brasil, abrange aproximadamente 2.000.000 Km2 na região central e detém cerca de um terço da biodiversidade
brasileira. A grande biodiversidade deste bioma é resultado das transições, dentro do Cerrado, para outros biomas como Amazônia e Pantanal (INSTITUTO SOCIOAMBIENTAL, 2008), como demonstrado na Figura 4.
Destaca-se pela presença de vegetação aberta com diferentes fitofisionomias de acordo com a altura e densidade das plantas lenhosas, denominadas Cerrado
Sensu Lato, Campo Limpo, Campo Sujo, Cerrado stricto sensu e Cerradão.
Entretanto, as fisionomias formam uma vegetação contínua, sem limites definidos (SCARIOT, SOUSA-SILVA e FELFILI, 2005). O Cerrado stricto sensu é a fitofisionomia mais extensa neste bioma.
A presença de diferentes formações ecossistêmicas dentro deste bioma torna o Cerrado um ambiente capaz de guardar vasta diversidade biológica – o Cerrado possui alto nível de endemismo e cerca de 4.400 espécies de plantas são exclusivas deste bioma (www.ibama.gov.br). É, inclusive, considerado a savana mais biodiversa do mundo e está gravemente ameaçada pelo extenso
desmatamento, queimadas e utilização de poluentes químicos – consequências da
expansão da fronteira agrícola direcionada à região Centro-Oeste a partir da década de 60.
Figura 4. Mapa da localização dos Biomas brasileiros. Observa-se o Bioma Cerrado na região central do país e seus contornos com todos os outros biomas, exceto o Bioma Pampa. Fonte: IBGE (disponível http://www.ibge.gov.br/home/presidencia/noticias/noticia_visualiza.php?id_noticia=169).
O solo do Bioma Cerrado possui baixa fertilidade, derivada principalmente da abundância em alumínio e da acidez proeminente, além da escassez de íons como fósforo e cálcio (INSTITUTO SOCIOAMBIENTAL, 2008; SCARIOT, SOUSA- SILVA e FELFILI, 2005).
Assim, por ser o Cerrado um ecossistema único no Brasil, com peculiaridades edáficas como acidez acentuada, a triagem das bibliotecas metagenômicas para a identificação de elementos de resistência do solo pode revelar novos mecanismos de ação relacionados à resistência antimicrobiana, assim como a outros processos metabólicos provenientes da interação e do metabolismo dos micro-organismos presentes no solo.
Justificativa
Este trabalho é proposto para a exploração funcional dos clones de duas bibliotecas metagenômicas previamente construídas com DNA total de amostras de solo de Cerrado stricto sensu.
Apesar do conhecimento de que a origem de genes de resistência antimicrobiana é ambiental, os ambientes naturais ainda são subestimados e predominam os estudos que envolvem micro-organismos patogênicos do ambiente clínico. A noção de que os micro-organismos interagem independentemente do ambiente em que residem e de que a pressão seletiva exercida pelo uso indiscriminado de antibióticos promove o aparecimento de micro-organismos multirresistentes deve levantar a urgência de avaliar os reservatórios ambientais dos genes de resistência e de seus mecanismos de ação e de transferência gênica.
A metagenômica torna-se a metodologia de escolha para este tipo de estudo, já que é conhecido menos de 1% dos micro-organismos de solo são prontamente cultiváveis. Esta técnica, permite, assim, que a amostragem do material genético dos micro-organismos seja muito maior daquela obtida com o estudo de apenas micro-organismos cultiváveis.
É estimulado também pelo conhecimento de que o solo é um ambiente subestimado, pouco explorado e rico em genes de resistência antimicrobiana, oriundos principalmente de micro-organismos ainda não cultiváveis. Assim, torna-se um ambiente promissor para a identificação de novos mecanismos de resistência antimicrobiana, já que a maioria dos estudos neste sentido envolvem a exploração de micro-organismos isolados do ambiente clínico.
A elucidação de novos mecanismos de resistência antimicrobiana auxilia no estudo da interação entre os micro-organismos no solo, além de possibilitar a identificação de novos genes que codifiquem atividade de resistência a antibióticos e que também estejam relacionados a outros processos metabólicos com aplicação biotecnológica. Torna possível também acessar como se dá a movimentação destes genes entre os micro-organismos, tanto no solo como para outros ambientes, como o hospitalar.
Objetivos
GeralAcessar o perfil de resistência antimicrobiana do solo de Cerrado stricto
sensu pelo screening de duas bibliotecas metagenômicas previamente construídas.
Específicos
1. Identificar e isolar clones resistentes a nove antibióticos β-lactâmicos em bibliotecas de pequenos e grandes insertos de DNA metagenômico de solo de Cerrado stricto sensu já existentes
2. Confirmar os fenótipos resistentes dos clones isolados;
3. Selecionar, da biblioteca de pequenos insertos, um clone resistente isolado dos antibióticos β-lactâmicos amoxicilina, carbenicilina, cefoxitina e penicilina G;
4. Acessar a multirresistência dos clones selecionados;
5. Definir a concentração inibitória mínima dos clones selecionados;
6. Sequenciar os insertos para identificação dos possíveis genes de resistência dos clones com fenótipos confirmados;
Material e Métodos
1. Amostra e BibliotecasAs bibliotecas metagenômicas utilizadas para o screening foram previamente construídas com um pool de amostras coletadas aleatoriamente em cinco diferentes pontos de uma área de Cerrado stricto sensu, localizada na reserva ecológica do IBGE no Distrito Federal (CASTRO, 2008).
As bibliotecas foram construídas em Escherichia coli EPI300-T1 (Epicentre
Biotechnologies, EUA) com dois vetores diferentes para comportar tamanhos de
insertos distintos: o vetor pCF430 (Figura 5) foi utilizado para a biblioteca de pequenos insertos – que têm tamanho mediano de 8 Kb – e o vetor pCC1FOS (Figura 6) para a biblioteca de grandes insertos, com tamanho de 35 Kb (CASTRO, 2008).
Figura 5. Mapa do vetor de clonagem pCF430 utilizado na construção da biblioteca de pequenos insertos. Observa-se os sítios de restrição e de clonagem (MCS), o gene de seleção antibiótica (tetA). Disponível em (http://gillnet.lab.nig.ac.jp/~cvector/map/pCF430.gif)
Figura 6. Mapa do vetor de clonagem pCC1FOS utilizado na construção da biblioteca de grandes insertos. Observa-se o gene de seleção antibiótica (ChlR) e a origem de replicação (oriV). Disponível em (http://www.EPI300bio.com/item.asp?id=385)
2. Antibióticos
Utilizou-se nos screenings nove antibióticos β-lactâmicos pertencentes aos grupos das penicilinas e das cefalosporinas. As estruturas estão disponíveis na Figura 7.
Figura 7. Estrutura dos antibióticos β-lactâmicos utilizados nos screenings. Representações obtidas do site do fabricante dos antibióticos (Sigma-Aldrich, EUA).