Figura 27. Esquema das possíveis ORFs identificadas no inserto de CFX12.
Este inserto metagenômico, analogamente à PG17, possui ORFs com similaridade à enzimas transposases. Este, entretanto, mostra duas transposases
flanqueando duas outras ORFs – uma similar ao sistema híbrido de dois
componentes de transdução de sinais (sensor/regulador) e outra similar à enzima metionina sintase.
O sistema de dois componentes (TCS) é o mecanismo dominante de sinalização, adaptação ambiental e modulação de comportamento de procariotos, presente também em arquéias, fungos e algumas plantas. Este sistema é ubíquo nestes organismos sendo, entretanto, ausente em mamíferos. Capta sinais externos e modula a resposta a mudanças ambientais de vão desde a variação da pressão osmótica, de pH, presença de compostos tóxicos, dormência, esporulação, formação de biofilme, patogenicidade e virulência, dentre outros (QIAN, HAN e HE, 2008; GOTOH, EGUCHI, et al., 2010; MARIJUAN, NAVARRO e DEL MORAN, 2010).
O sistema, então, consiste de um sensor, representado por uma histidina quinase, comumente chamado de sensor quinase (HK) e um regulador de resposta (RR), sendo componentes independentes.
O sensor quinase é uma proteína homodimérica associada à membrana celular, cujo domímio N-terminal, extracelular, é responsável pela ligação à molécula sinalizadora. Ao ligar-se ao sinal externo, o sensor HK autofosforila em um resíduo conservado de histidina na região C-terminal. Este resíduo então transfere o fosfato
para outro resíduo conservado no regulador de resposta citoplasmático – neste
caso, em um resíduo conservado de ácido aspártico – e esse é o responsável pela
regulação em nível de transcrição gênica (QIAN, HAN e HE, 2008; GOTOH, EGUCHI, et al., 2010; MARIJUAN, NAVARRO e DEL MORAN, 2010).
Assim, o sistema de dois componentes clássico é composto por dois genes diferentes, ambos com domínios distintos. No entanto, são também descritos componentes híbridos, que possuem, em uma só sequência, os domínios do sensor HK e do regulador de resposta RR. O esquema da sinalização por componentes clássicos e híbridos está representado na Figura 28.
A ORF1 é similar ao sistema híbrido de transdução de sinal de dois componentes – informação dada pela sequência do besthit no Blastp. Entretanto, nenhum domínio relacionado a reguladores de resposta foram identificados em nenhuma dessas duas sequências. Ainda, a similaridade é baixa (42%). Assim, sugere-se que a ORF1 é referente ao sensor quinase, que é parte integrante do sistema de dois componentes de transdução de sinal.
O sistema de transdução de sinal de dois componentes pode atuar em diversos processos celulares, como descrito acima. Muitos atuam no sentido de estimular o crescimento celular e virulência em cepas patogênicas. Dessa maneira, a inibição deste sistema pode ser realizada para combater microorganismos multirresistentes, já que a modulação é em nível de transcrição gênica, ao contrário dos antibióticos que agem nas moléculas efetoras (GOTOH, EGUCHI, et al., 2010).
Figura 28. Representação do (a) sistema de transdução de sinal de dois componentes clássico e (b) o sistema de transdução de sinal de dois componentes híbrido. (a) Neste sistema, o sensor quinase, aderido à membrana celular, é independente do regulador de resposta, que é citosólico. O domínio ATPase em HK promove autofosforilação em resíduo de histidina no sensor que transfere o fosfato para resíduo conservado de ácido aspártico no regulador de resposta. Este, por sua vez, promove regulação da transcrição de genes alvo pela ligação à molécula de DNA. (b) O sistema híbrido diferencia-se por possuir o sensor quinase e o regulador de resposta em um único polipeptídeo integrado à membrana. O processo de fosforilação é análogo ao sistema clássico e a regulação de resposta é dada pelo domínio intracelular do polipeptídeo. HK – sensor quinase; RR – regulador de resposta; H – histidina; D – ácido aspártico; ATP – adenosina trifosfato; ADP – adenina difosfato. As moléculas sinalizadoras estão representadas como círculo e hexágono acima das figuras.
A diferença no crescimento deste clone em relação ao controle negativo nos antibióticos β-lactâmicos testados demonstra a atuação destas moléculas na modulação do comportamento de microorganismos quando há mudança nas condições ambientais externas. Neste caso, a adição de antibióticos ao meio estimulou o crescimento do clone, o que evidencia o papel dos antibióticos como moléculas sinalizadoras externas que estimulam a regulação do comportamento de microorganismos.
Sugere-se o isolamento da ORFs para comprovar a atuação deste gene na resistência antimicrobiana e na sinalização microbiana. Alem dos antibióticos testados, sugere-se o teste com outros substratos como antibióticos de outras classes, como foi proposto para os outros clones.
De modo similar à ORF identificada em AMX3, a ORF2 de CFX12 é uma enzima que têm papel em diversos processos celulares. A ORF2 é similar à enzima metionina sintase, que catalisa a conversão de homocisteína em metionina. Dentre outras vias, esta enzima também participa do processo de síntese de moléculas sinalizadoras pertencentes ao sistema QS, mais especificamente de AI-2, como a ORF1 de AMX3.
A partir da metionina, a S-adenosil-metionina (SAM) é formada, que é substrato para as enzimas metiltransferases, como citado na discussão de AMX3. A Figura 29 mostra vias de síntese da molécula sinalizadora AI-2 e em que processos as enzimas metionina sintase e metiltransferase dependente de SAM são atuantes.
A produção de AI-2 ainda depende de outras enzimas que também atuam na eliminação do componente tóxico SAH da célula – Pfs e LuxS. Esta última é encontrada em diversos gêneros bacterianos e, em função disso, considera-se que AI-2 é um sinalizador universal. Esta molécula já foi relacionada à indução de luminescência em Vibrio harveyi e no controle da expressão de tranportadores ABC em Salmonella thyphimurium (SUN, DANIEL, et al., 2004).
Assim, tanto a ORF1 em AMX3 quanto a ORF2 de CFX12 têm papel indireto na síntese de moléculas sinalizadoras, já que atuam na reciclagem de SAM e SAH, substrato para a síntese de precursores de AI-2, como demonstrado na Figura 29.
A presença destas ORFs nos insertos metagenômicos triados para resistência antimicrobiana apontam também para a relação entre antibióticos, genes de resistência e comunicação microbiana.
O tamanho inferido para a inserto de CFX12 foi de aproximadamente 7 Kb. Entretanto, só foram sequenciados 5,4 Kb, faltando aproximadamente 2 Kb. O sequenciamento está em andamento e, assim, a análise acima é derivada dos resultados disponíveis, sendo portanto parcial. Devido a este fato, explica-se a diferença grande de tamanho entre a ORF1 e os hits no Blastp. Quando alinhadas, as sequências formam blocos muito distintos e observa-se que a região N-terminal é muito diferente entre as sequências (Apêndice C).
Entretanto, observa-se também que a região C-terminal é bem homogênea e mais similar entre as sequências. Esta região é a que comporta o domínio ATPase e histidina quinase, que é comum às enzimas HK. Ainda, visualiza-se o resíduo de histidina conservado na região C-terminal correspondente ao local do domínio histidina quinase. Assim, a sequência do inserto de CFX12 deve ser confirmada.
Figura 29. Vias de síntese do sinalizador AI-2. Observa-se a atuação das enzimas metionina sintase (MetE) e da metiltransferase dependente de SAM (SAM dependent transmethylases), possivelmente codificadas pelas ORF1 de AMX3 e ORF2 de CFX12, respectivamente. Para a produção de AI-2 são atuantes também as enzimas Pfs e LuxS. (Reprodução de SUN, DANIEL, et al., 2004).
3. Análise das ORFs identificadas no clone metagenômico CRB2 isolado da