O sequenciamento do inserto de AMX3 revelou que este fragmento de DNA possivelmente é derivado de uma acidobacteria. Todos as identidades no banco de dados BLAST são sequências provenientes deste filo e sabe-se que este é abundante no solo de Cerrado (ARAUJO, CASTRO, et al., submetido em 2011).
A ORF3 de AMX3 é similar à enzima “intradiol ring-cleavage dioxygenase” de Candidatus koribacter versatilis Ellin345, uma acidobacteria. Está posicionada no centro do inserto, o que torna possível isolar o gene inteiro (Figura 25). Esta enzima está envolvida na quebra de anéis aromáticos no metabolismo bacteriano e, por este motivo, é amplamente distribuída entre as bactérias, principalmente as de solo (HARAYAMA e REKIK, 1989).
Figura 25. Esquema das possíveis ORFs identificadas no inserto de AMX3.
As dioxigenases são enzimas que adicionam os átomos do oxigênio molecular aos substratos aromáticos, o que resulta na quebra do anel. São divididas entre dioxigenases intradiol e extradiol. As primeiras são específicas para a quebra do anel entre dois radicais hidroxilas e a última é responsável pela quebra adjacente a um dos radicais –OH (normalmente a quebra 3,4). Diferem também no grupo prostético necessário para a atividade enzimática: enzimas intradiol utilizam Fe III e as extradiol, Fe II (HARAYAMA e REKIK, 1989; PHALE, BASU, et al., 2007).
O substrato principal das enzimas dioxigenases intradiol é o catecol e seus derivados. Os substituintes podem ser halogênios, grupos metil, metoxi, nitro, etc. A
especificidade para os diferentes anéis substituídos varia conforme o tipo de enzima (BRODERICK, 1999).
As dioxigenases intradiol são ainda classificadas em 1,2-catecol dioxigenases, 3,4-protocatecuato dioxigenases e clorocatecol dioxigenases e a produção celular pode ser induzidas pela presença de moléculas aromáticas como única fonte de carbono no meio (BRODERICK, 1999). Estas enzimas participam de diversas vias metabólicas e, por isso, são amplamente distribuídas nos micro- organismos, principalmente os de solo. A Figura 26 mostra um exemplo de via metabólica na qual estas enzimas fazem parte. Observa-se que os produtos finais são compostos que integram as vias de metabolismo responsáveis pela produção de energia celular.
A presença de vias metabólicas como a representada na figura a seguir possibilita que as bactérias utilizem compostos aromáticos – ou aromáticos
halogenados – como principal fonte de carbono, o que auxilia na descontaminação
de solos poluídos com resíduos aromáticos (pesticidas, desinfetantes, tintas, herbicidas, etc). Este fato desenvolve grande potencial para o uso destas enzimas na biorremediação de solos contaminados.
O dendograma da Figura 19 mostra que a sequência da ORF3 e os hits do Blastp não agrupam com as sequências de membros da superfamília de dioxigenases bem caracterizadas incluídas na análise (exemplos de 1,2 catecol- dioxigenases, 3,4 protocatecuato-dioxigenases, clorocatecol dioxigenases e extradiol-dioxigenases). Isto pode ser explicado pelo fato de que as sequências de acidobacteria do banco de dados são ORFs putativas hipotéticas derivadas de um filo muito pouco estudado e com poucas espécies sequenciadas (WARD, CHALLACOMBE, et al., 2009).
Isto pode refletir dois resultados, basicamente: as sequências foram mal anotadas e as inferências de função foram equivocadas, ou as sequências de acidobacteria e a ORF3 são realmente intradiol dioxigenases, a última, porém, com peculiaridades de estrutura primária que as diferencia das outras já catalogadas – ou seja, é possivelmente um novo gene.
O último fato pode levar à caracterização de novas enzimas da superfamília das intradiol dioxigenases. Entretanto, testes adicionais devem ser realizados para
confirmar a função degradativa de compostos aromáticos – especificamente do catecol, característica destas dioxigenases.
Figura 26. Representação de duas vias metabólicas as quais as enzimas da superfamília das intradiol dioxigenases participam. Estão representadas as enzimas 1,2-catecol dioxigenases, 3,4- protocatecuato dioxigenase (à esquerda) e clorocatecol dioxigenase (à direita). As duas vias são exemplos de enzimas cromossomais e plasmidiais identificadas em Pseudomonas sp. (Reprodução de BRODERICK, 1999). Observa-se que os produtos finais são pertencentes à via de metabolismo celular para produção de energia, o que evidencia a utilização de compostos aromáticos como fonte de carbono.
Outra observação importante é a presença da sequência de Acidobacterium
sp, referente à proteína “CNA b domain” – aqui citada como CNA-b. A ORF3 possui
domínio conservado desta família de proteínas, que está relacionada à aderência ao colágeno.
A proteína CNA (collagen adhesin) é responsável pela aderência ao colágeno e está envolvida em processos patogênicos em Staphylococcus aureus. É dividida em dois domínios principais: “domínio A” e “domínio B”. O primeiro é o que adere ao colágeno em si e a função do domínio B não é muito elucidada – entretanto, infere-se que tem a função de apresentar o domínio A, afastando-o da membrana celular. Há a hipótese, também, de que o domínio B possui sítios de ligação a outros substratos fora o colágeno (RICH, DEMELER, et al., 1998).
A presença deste domínio em uma sequência derivada de amostras ambientais, onde micro-organismos patogênicos são pouco presentes, é curiosa. Observa-se que a única sequência representante deste domínio é a de
Acidobacterium sp., que é uma proteína hipotética – novamente, derivada de um filo
pouco caracterizado. Ainda, a identidade é baixa (30%) e o alinhamento não mostra muitos resíduos conservados, conforme Apêndice C.
Ainda, a sequência de Acidobacterium sp não demonstra registros de domínios conservados. Outra observação é que sequências referentes ao domínio B
de CNA obtida no NCBI Protein6 possuem conservação repetitiva do domínio CNA-b
– já que é comum a presença de repetições deste domínio na estrutura da adesina. A ORF3 apresenta somente um domínio, o que não é característico.
É comum a presença de genes responsáveis pela degradação de compostos aromáticos em elementos móveis (PHALE, BASU, et al., 2007). Contudo, este fato não pode ser comprovado nesta ORF, já que o inserto é pequeno e não abordou o contexto em que os genes estão inseridos.
Entretanto, é possível que as ORFs identificadas estejam em um transposon ou em um plasmídeo – assim, também é possível que a presença do domínio B de
6 Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252 (YP_042111.1); Clostridium perfringens str. 13
(NP_150050.1); Enterococcus faecalis OG1RF (AEA 94585.1) e Exiguobacterium sp. AT1b (ACQ70011.1).
CNA seja fruto de uma recombinação, o que explica a baixa similaridade com as sequências de CNA-b e a presença de somente um domínio conservado de CNA-b nesta ORF.
Assim, para caracterizar a ORF e comprovar a função na quebra de anéis aromáticos e componentes aromáticos halogenados, testes funcionais devem ser realizados com os substratos padrão conhecidos para a ação de enzimas catecol intradiol dioxigenases – catecol e seus derivados e também os antibióticos utilizados neste estudo (que também são compostos com anéis aromáticos) e outros compostos relacionados à contaminação de solos, como fertilizantes e herbicidas. Caso esta função seja comprovada, deve-se avaliar o desempenho da enzima isolada na descontaminação de amostras ambientais poluídas, principalmente as de solo.
Ainda, para avaliar a utilização destes compostos como fonte de carbono (muitas vezes como fonte única de carbono), sugere-se o crescimento do subclone – contendo o gene isolado – em meio de cultura mínimo com os substratos acima especificados.
O inserto AMX3 mostra duas ORFs adicionais: uma contém domínios conservados da superfamília de metiltransferases dependentes de S- adenosilmetionina (AdoMet_MTases). Estas proteínas estão envolvidas na transferência de grupos metil do cofator SAM (S-adenosil-metionina) para diferentes moléculas – DNA, RNA, proteínas e pequenas moléculas.
A metilação está envolvida em diversos processos celulares e faz parte do metabolismo normal das células – a S-adenosil-metionina (SAM) é doador de grupos metil para substratos celulares, sendo o cofator celular mais utilizado depois do ATP (FONTECAVE, ATTA e MULLIEZ, 2004).
A transferência do radical metil de SAM para os diversos substratos promove a produção de S-adenosil-homocisteína (SAH), que é um composto tóxico. Assim, em algumas bactérias, ele é degradado para a produção de outras moléculas. Uma das vias em que este produto é utilizado está relacionada à produção de moléculas sinalizadoras pertencentes à classe AI-2 (LuxS-autoinducer-2) do sistema QS de modulação e transdução de sinal. Esta via sinalizadora é inespecífica e é a que
promove menor custo energético para as células (KELLER e SURETTE, 2006). Está demonstrada no próximo tópico, conforme Figura 29.
Entretanto, a presença de um gene que codifica uma metiltransferase neste inserto não prova a sua utilização em algum processo específico, como na produção de moléculas sinalizadoras, já que esta enzima é amplamente utilizada no metabolismo celular.
A ORF2 é similar a um proteína hipotética, sem domínios conservados. Este gene é possivelmente derivado de uma acidobacteria ainda não cultivada ou caracterizada. Ela também não está interrompida e possível isolá-la do inserto para futuras análises.
As identidades da ORF2 no banco de dados mostra similaridades muito baixas e, dentre as dez primeiras sequências similares no Blastp, três possuem referências à enzimas da classe das intradiol dioxigenases. Assim, para esta ORF, sugere-se que sejam realizados os mesmos testes de bancada propostos para a ORF3.
Entretanto, não é possível afirmar que a ORF3 sozinha, ou qualquer outra ORF neste inserto, está relacionada à resistência aos antibióticos que foi observada. Para comprovar a função de cada gene na resistência, será necessário isolar e subclonar todos eles em novo vetor para realizar novos testes de resistência e multirresistência. É necessário acessar também se o fenótipo observado é resultado de uma sinergia entre as ORFs identificadas.
Ademais, a análise de sequências provenientes do filo Acidobacteria é difícil já que a amostragem nos bancos de dados é muito limitada. Estão depositados, atualmente, somente três genomas de espécies de Acidobacteria (WARD, CHALLACOMBE, et al., 2009).
A identificação destas três ORFs, que provavelmente são mesmo sequências de Acidobacteria, ressalta a validade da utilização da metagenômica como metodologia de escolha para este tipo de estudo. Ela mostra que realmente está sendo acessado o material genético de micro-organismos ainda não cultiváveis ou ainda muito pouco estudados.
2. Análise das ORFs identificadas no clone metagenômico CFX12 isolado da