5. Regnskapsanalyse
5.4 Analyse av målefeil og justering
5.4.1 Justering av målefeil
Artigo científico a ser enviado a Revista Animal Reproduction Science
Concentrações de 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α, progesterona e estradiol após administração de cloprostenol em diferentes períodos do puerpério
de búfalas
A. S. Camargos1, E. Oba1*, A. A. Ramos2, J. C. P. Ferreira1, D. G. Souza1, A. M. Jorge2, N. T. Carvalho3
1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Distrito Rubião Jr. s/ n., Botucatu, SP, Brasil
2 Departamento de Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia – UNESP, Fazenda Lageado, Botucatu, SP, Brasil
3 Agência Paulista de Tecnologia do Agronegócio – APTA, Fazenda
Experimental, Rodovia Régis Bittencourt km 435, Registro, SP, Brasil
* Corresponding author. Endereço: Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Distrito Rubião Jr. s/ n., Botucatu, SP, Brasil. E-mail: [email protected] (E. Oba)
1. Introdução
Para o retorno à atividade reprodutiva, é importante a involução uterina rápida. A liberação de prostaglandina F2α (PGF2α) após o parto intensifica o
processo de involução (Kindahl et al., 1999). O conhecimento da eficácia das prostaglandinas no processo de involução uterina levou ao desenvolvimento de protocolos para utilização dos seus análogos no pós-parto (Fernandes et al., 2002). Devido ao baixo custo e fácil aplicação, os protocolos de utilização de prostaglandina exógena podem ser viáveis em qualquer rebanho, independentemente do número de animais. A utilização de análogos da prostaglandina pode levar à aceleração da involução uterina e, por consequência, redução do intervalo entre partos (Ferraz, 2006).
Durante o puerpério, há intensa produção de PGF2α pela região
intercaruncular da superfície epitelial do endométrio (Asselin et al., 1998; Skarzynski et al., 2000). A PGF2α é um metabólito do ácido aracdônico, que é
liberado dos fosfolipídeos pela fosfoslipase A2 (PLA2). O endométrio contém
grandes quantidades de ácido aracdônico e tem a habilidade de metabolizá-lo em uma variedade de produtos (Auletta e Flint, 1988). A síntese de prostaglandinas ocorre em etapas pela enzima peroxidase citosólica e por dois tipos de enzimas ligadas à membrana (cicloxigenase-COX e isomerase endoperoxidase; Salamonsen e Findlay, 1990).
Em bovinos, a expressão do gene COX nas células do endométrio pode ser influenciada pela presença de esteróides ovarianos. Progesterona e
estrógeno podem afetar diretamente a secreção de PGF2α basal pelo
endométrio (Xiao et al., 1998). A progesterona atua estimulando a produção basal de PGF2α pelas células e tecidos do endométrio bovino (Skarzynski et al.,
1999). Por outro lado, o estradiol diminui a produção basal de PGF2α pela
de PGF2α estimulada pela ocitocina em células endometriais de bovinos
cultivadas por longo período (Okuda et al., 2002).
Na espécie bubalina, a relação entre a produção de PGF2α após o parto
e os hormônios esteróides ainda não foi descrita, assim como se há efeito endócrino deste protocolo hormonal a base de PGF2α sintética. Deste modo, o
objetivo deste estudo foi verificar se a aplicação de análogo sintético de prostaglandina (cloprostenol), no puerpério precoce ou intermediário, induz efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica, além de mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de búfalas pós-parto.
2. Material e Métodos
2.1 Seleção dos animais e grupos experimentais
O estudo foi realizado entre Março e Julho de 2012 na Fazenda Experimental Lageado UNESP (Botucatu, SP) e na Fazenda Santa Helena (em Registro, SP). O rebanho experimental foi constituído por 30 búfalas Murrah (entre 1 e 9 partos) gestantes, apresentando escore de condição corporal entre 3,5 e 4,0 (escala de 0 a 5). Para tanto, os animais permaneceram em piquetes separados para o monitoramento do parto. A alimentação foi composta de pastagem Brachiaria decumbens, com fornecimento de água e suplemento mineral ad libitum. Os animais foram submetidos tanto a monta natural como a inseminação artificial em tempo fixo.
Somente foram incluídos no estudo aqueles animais que apresentaram parto normal sem retenção de placenta, ou seja, com eliminação dos anexos fetais dentro das primeiras 12 horas pós-parto.
Após o parto, as búfalas foram divididas aleatoriamente, de acordo com a ocorrência das parições, em três grupos de tratamento: CONT (controle; N = 10) - aplicação de 2mL de soro fisiológico por via intramuscular (IM) nos dias dois e cinco pós-parto (dia 0 = parto); CLO2 (N = 10) - aplicação de 2mL de cloprostenol sódico (0,530mg, Ciosin, Intervet Schering-Plough) IM nos dias dois e cinco pós-parto; e CLO15 (N = 10) - aplicação de 2mL de cloprostenol sódico IM nos dias 15 e 20 pós-parto.
2.2 Exame ginecológico
Exames ginecológicos foram realizados nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós- parto. Inicialmente, foi avaliado o grau de involução uterina, via palpação transretal, conforme uma modificação do escore de Grunert (1980). O grau de involução uterina foi classificado por uma escala de 1 a 3, sendo: Grau 1 - útero pouco involuído com a totalidade da sua massa na cavidade abdominal, apresentando grande assimetria entre os cornos uterinos, não sendo possível examinar toda sua extensão; Grau 2 - útero com parte de sua massa na cavidade abdominal, com razoável assimetria entre os cornos, sendo possível a palpação e o exame de toda a sua extensão e; Grau 3 - útero em quase sua totalidade na cavidade pélvica, apresentando-se simétrico ou com discreta assimetria.
Os animais foram submetidos também a exame ultrassonográfico em modo B para avaliação do acúmulo de fluido intrauterino, conforme descrito por Krueger et al. (2009). O acúmulo de fluido foi quantificado pela média de três avaliações do diâmetro do corno uterino e classificado em uma escala de 0 a 3, onde: 0 - sem fluido; 1 - entre 0 e 1,5 cm; 2 - entre 1,5 e 2,5 cm e; 3 - maior que 2,5 cm.
Adicionalmente, o exame em modo B também foi utilizado para avaliação da atividade ovariana cíclica pós-parto. Para tanto, foi considerada em atividade ovariana cíclica aquela búfala que apresentava folículo maior que 10 mm e/ou corpo lúteo nos ovários direito e esquerdo.
2.3 Coleta de sangue e dosagens hormonais
Após cada exame ginecológico, foram colhidas amostras de sangue da veia jugular em tubos heparinizados para dosagem de PGFM, estrógeno e progesterona, por sistema de coleta a vácuo. As amostras foram mantidas em caixa térmica refrigerada por 10 minutos e centrifugadas (2500 giros) por 15 minutos. O plasma foi acondicionado em microtubos e congelado (-20º C) para análise posterior.
As concentrações de estrógeno e progesterona foram mensuradas pelo uso de kits diagnósticos em fase sólida Coat-a-Count (Diagnostics Products
Corporation®, Los Angeles, CA, USA), de acordo com as instruções do
fabricante, por leitura em sistema de radioimunoensaio (Packard Cobra II Auto Gamma), no Laboratório de Endocrinologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP Campus Botucatu.
Já a dosagem de PGFM foi realizada com uso de kit diagnóstico (DetectX 13, 14-dihydro-15-keto-PGF2α®, Arbor Assays, EUA) por método de
enzimaimunoensaio, conforme instruções do fabricante e leitura em espectrofotômetro, no Laboratório de Proteína de Fase Aguda e Monitorização Não Invasiva da Reprodução e do Bem-estar Animal.
2.4 Análise estatística
Para a análise estatística, os dados foram submetidos à análise de variância pelo procedimento descrito no GLM do SAS (2012), tendo como causas de variação o efeito do tratamento (CONT, CLO2 e CLO15), dos dias de avaliação (2, 7, 14, 21 e 28), da atividade ovariana (presente ou ausente) e a interação tratamento versus dia. As diferenças entre médias foram submetidas ao teste de Tukey a 5% de probabilidade para todas as causas de variações.
3. Resultados e Discussão
3.1 Involução uterina, acúmulo de fluido e atividade ovariana
As mudanças no grau de involução uterina das búfalas pós-parto dos diferentes grupos recebedores ou não de análogo de PGF2α (CONT, CLO2 e
CLO15) estão representadas na Fig. 1. Não houve diferença significativa (P > 0,05) entre os grupos apenas no exame ginecológico do dia 2 após o parto. Em
todos os animais, foi observado útero com volume ainda muito aumentado e assimétrico, posicionado na cavidade abdominal.
A partir do exame ginecológico do dia 2, o grupo CLO2 apresentou um grau médio de involução uterina significativamente maior que os demais grupos do estudo (P < 0,05). O grupo CLO 15 apresentou o menor grau de involução uterina até o exame ginecológico do dia 14, quando apresentou um aumento expressivo do grau de involução. No dia 28 após o parto, já apresentava média maior que do grupo controle.
Fig. 1. Grau de involução uterina (média ± desvio padrão) de búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de
cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto.
Os períodos de maior velocidade de involução uterina detectados pelo exame de palpação transretal foram entre os 7 e os 21 dias pós-parto. A maior velocidade dos grupos tratados com cloprostenol coincidiram com o término
Grau de in
volução uter
ina
dos protocolos hormonais, correspondendo aos 7 e 14 dias para os grupos CLO2 e CLO15, respectivamente.
Na última avaliação, aos 28 dias, nenhum dos grupos acompanhados apresentou uma involução uterina completa. Apesar de os grupos tratados terem obtido médias significativamente mais altas, o grau 3 não foi alcançado.
A involução uterina completa-se por volta de 25 a 39 dias na espécie bubalina (Baruselli et al., 1996; Devanathan et al., 1987; Ferraz, 2006; Ferreira et al., 2010), podendo variar de acordo com a raça, número de partos, lactação, separação do bezerro, estacionalidade reprodutiva, precipitação pluviométrica e oferta de pastagem (Hegazy et al., 1994; Ribeiro, 1996; Vale e Ribeiro, 2005). Já foi relatada uma redução média de 4,2 dias no período total de involução uterina, após a aplicação de cloprostenol nos dias 2 e 7 pós-parto (Ferraz, 2006).
As médias dos grupos CONT, CLO2 e CLO15 para acúmulo de fluido intrauterino nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós-parto estão ilustrados na Fig. 2. Assim como para a involução uterina, ao exame no dia 2 após o parto, não houve diferença significativa entre os grupos avaliados. Neste dia, foi observado o maior volume de líquido no interior do útero em relação aos outros dias do estudo.
Na avaliação seguinte (dia 7), os grupos CLO2 e CLO15 apresentaram menor acúmulo de fluido em relação ao grupo controle. O grupo CLO2 continuou apresentando diminuição expressiva até o dia 21, diferente do grupo CLO15 que não mostrou alterações entre os dias 7 e 14.
Fig. 2. Acúmulo de fluido intrauterino (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração
de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto.
O período dos exames ginecológicos coincidiu com o período de eliminação de lóquio característico do puerpério fisiológico. A quantidade de líquido produzido e excretado diminui conforme o volume uterino é reduzido pelas contrações miometriais (Noakes, 1991). Aos sete dias após o parto, o volume de lóquio liberado ainda é alto, em torno de 500 mL (Grunert e Birgel, 1982).
As perdas mais significativas de conteúdo uterino ocorreram nos intervalos 7-21 e 21-28 dias para os grupos CLO2 e CLO15, respectivamente. Estes períodos coincidem com o término dos protocolos hormonais aplicados.
De acordo com os resultados observados anteriormente para o grau de involução uterina e acúmulo de fluido, o cloprostenol atuou positivamente sobre o tônus uterino, favorecendo a eliminação de lóquios. Já foi descrito anteriormente que a ação miotônica da prostaglandina endógena é
Ac úmu lo de fluido intraut e rino Dias
potencializada quando administra-se prostaglandina exógena, levando a maior amplitude das contrações uterinas (Ferraz, 2006).
Uma maior e mais rápida eliminação de conteúdo uterino no puerpério é benéfica, já que auxilia o processo de eliminação de restos placentários e fetais e reparação do tecido endometrial. Além disto, diminui a chance de uma infecção uterina (Noakes, 1991). A ação benéfica do cloprostenol sobre a eliminação de fluido uterino de búfalas pós-parto foi relatada anteriormente por Camargos et al. (2012).
Não foram observadas diferenças significativas de idade e escore de condição corporal dos animais para nenhuma das variáveis avaliadas (P > 0,05). Quanto à atividade ovariana, foi observada presença de folículo de diâmetro maior que 10 mm aos 26,6 dias no grupo CLO2. Nos grupos CONT e CLO15, os mesmos não foram observados até os 28 dias pós-parto.
Os animais que apresentaram reinício da atividade ovariana cíclica mais precoce foram aqueles que apresentaram a maior involução uterina. Houve diferença significativa do grau médio de involução uterina em búfalas com atividade ovariana presente (2,79 ± 0,23) e ausente (1,55 ± 0,24; P < 0,05). O mesmo ocorreu com relação ao grau médio de acúmulo de fluido intrauterino (0,29 ± 0,19 e 2,14 ± 0,20 para atividade ovariana presente e ausente, respectivamente).
Há correlação positiva da 1ª ovulação com a completa involução uterina, ou seja, animais com mais rápida involução uterina retornarão também mais rapidamente à atividade ovariana (Kozicki, 1998). O retorno da atividade ovariana cíclica de búfalas Murrah (presença de folículo maior que 10 mm)
ocorre em média aos 37 dias. O primeiro estro, seguido de comportamento, é relatado com variação de 24 a 100 dias após o parto (Baruselli, 1992).
3.2 Concentrações hormonais
A concentração de progesterona plasmática de búfalas nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 do puerpério estão representados na Fig. 3. Quanto aos tratamentos administrados, houve diferença significativa apenas entre CONT e CLO2 (P < 0,05). Com relação aos dias avaliados, todos apresentaram diferença significativa entre si quanto à concentração plasmática de progesterona (P < 0,05).
Fig. 3. Concentração de progesterona (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração
de cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto.
Nas primeiras duas semanas após o parto, as concentrações de progesterona foram baixas (até 0,25 ng/mL) para todos os grupos. Enquanto o
Dias
Concentr
ação
de progestero
grupo controle apresentou um aumento progressivo, os grupos recebedores de cloprostenol (CLO2 e CLO15) apresentaram um decréscimo das concentrações.
Entre 14 e 21 dias, houve um aumento significativo nas concentrações dos grupos CONT e CLO15, atingindo valores nas concentrações plasmáticas de progesterona acima de 0,4 ng/mL aos 21 dias pós-parto. Este pico não foi observado no grupo CLO2, que continuou apresentando baixa concentração de progesterona até o dia 28.
As búfalas com atividade ovariana cíclica apresentaram nível de progesterona significativamente mais baixo que aquelas em anestro (0,17 ± 0,00 e 0,23 ± 0,00 ng/mL, respectivamente; P < 0,05). Segundo Mishra e Prakash (2005), valores de progesterona plasmática menores de 0,2 ng/mL caracterizam que o animal está em estro.
Os resultados observados na mensuração de PGFM durante o puerpério estão ilustrados na Fig. 4. O grupo CLO2 diferiu significativamente de CONT e CLO15 (P < 0,05), apresentando concentrações de PGFM mais baixas. Também foram observadas diferenças significativas com relação aos dias de coleta. O dia 2 apresenta valor de PGFM maior que o dia 7, assim como os dias 14 e 21 apresentam concentrações maiores que o dia 28 pós-parto.
Aos 2 dias após o parto, o valor de PGFM do grupo CLO2 foi significativamente menor que os grupos CONT e CLO15. No entanto, foi observado um decréscimo nas concentrações hormonais destes grupos até o dia 7, quando igualaram-se (CLO15) ou aproximaram-se (CONT) ao grupo CLO2.
Fig. 4. Concentração de PGFM (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah dos grupos CONT (controle), CLO2 (administração de cloprostenol nos dias 2 e 5) e CLO15 (administração de
cloprostenol nos dias 15 e 20) entre os dias 2 e 28 pós-parto.
Os grupos CONT e CLO2 apresentaram valores máximos de PGFM aos 14 dias pós-parto. No entanto, o maior valor observado foi do grupo CLO15, aos 21 dias, coincidindo com o término do protocolo hormonal administrado. Entre 21 e 28 dias, todos os grupos apresentaram uma diminuição das concentrações de PGFM plasmática.
De acordo com os resultados deste estudo, a administração de prostaglandina exógena na primeira semana após o parto, não potencializa a produção e secreção de prostaglandina endógena pelo endométrio. Como neste período já ocorre fisiologicamente intensa produção de PGF2α endógena,
pode ser que o valor elevado de prostaglandina exógena sature as ligações hormônio-receptor, induzindo um feedback negativo na produção de PGF2α
endógena.
A administração de prostaglandina exógena na terceira semana após o parto induziu um aumento na concentração plasmática de PGFM, sugerindo
Concentr ação de PGFM (ng/ mL) Dias
que o cloprostenol foi eficaz em induzir a produção e secreção de PGF2α
endógena neste período. Aos 14 dias, a concentração plasmática de PGFM já está a metade em relação ao valor do dia do parto (Mishra e Prakash, 2005). Deste modo, outro aumento elevado pode ser alcançado neste período.
Assim como foi observado para a progesterona, as búfalas com atividade ovariana funcional apresentaram valor de PGFM significativamente mais baixo que aquelas em anestro (0,22 ± 0,02 e 0,30 ± 0,02 ng/mL, respectivamente; P < 0,05). Não há possibilidade de ocorrer ovulação pós- parto, até que a liberação de PGF2α cesse ou que esteja muito próxima aos
valores basais, fato que ocorre a partir da quarta semana após o parto (Kindahl et al.,1992; Vale e Ribeiro, 2005).
Não foi observada diferença significativa nas concentrações plasmáticas de estradiol entre os tratamentos estudados (P > 0,05). Foi observada diferença significativa apenas entre os dias de coleta. A concentração média de estradiol plasmático até os 28 dias pós-parto das búfalas acompanhadas está representada na Fig. 5.
A concentração de estrógeno aumentou significativamente entre 2 e 7 dias após o parto, coincidindo com a diminuição das concentrações de PGFM neste período. O estradiol diminui a produção basal de PGF2α pela down-
regulation da COX-mRNA (Xiao et al., 1998).
No entanto, a mesma diferença não foi observada entre 7 e 14 dias, onde a concentração de estradiol permaneceu constante. O valor máximo foi observado aos 21 dias, seguido de uma diminuição acentuada nos sete dias subsequentes.
Fig. 5. Concentração de estradiol (média ± desvio padrão) em búfalas Murrah entre os dias 2 e 28 pós-parto.
De acordo com os resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que a administração de prostaglandina exógena pode levar a alterações dos níveis hormonais de búfalas pós-parto, culminado em mais rápida involução uterina e eliminação de lóquio nesta espécie.
Resumo
O objetivo deste estudo foi verificar se a aplicação de cloprostenol, no puerpério precoce ou intermediário, induz mudanças nas concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol de búfalas pós-parto, além de efeitos sobre a involução uterina, acúmulo de fluido intrauterino e retorno da atividade ovariana cíclica. 30 búfalas Murrah foram divididas aleatoriamente em três grupos: CONT (solução salina); CLO2 (cloprostenol nos dias 2 e 5 pós- parto) e; CLO15 (cloprostenol nos dias 15 e 20 pós-parto). Exames
Concentr ação de estr adiol (p g/mL) Dias
ginecológicos foram realizados nos dias 2, 7, 14, 21 e 28 pós-parto, onde foram avaliados o grau de involução uterina, o acúmulo de fluido intrauterino e a atividade ovariana. Após os exames, foram coletadas amostras de sangue para dosagem das concentrações plasmáticas de progesterona, PGFM e estradiol. O grupo CLO2 apresentou maior involução uterina, retorno mais rápido à atividade ovariana cíclica e menores concentrações plasmáticas de progesterona e PGFM em relação aos demais grupos (P < 0,05). Os grupos CLO2 e CLO15 apresentaram menor acúmulo de fluido intrauterino quando comparados ao grupo CONT (P < 0,05). Não foi observada diferença significativa na concentração de estradiol entre os grupos experimentais (P > 0,05). A aplicação de análogo de prostaglandina em búfalas pós-parto induz alterações hormonais e fisiológicas, culminando em mais rápida involução uterina e eliminação de lóquio nesta espécie.
Palavras-chave: PGFM, Bubalus bubalis, involução uterina, atividade ovariana, enzimaimunoensaio, radioimunoensaio
Agradecimentos
Referências
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