Driftsfordel

Fluxo 5 mL/min 1 mL/min

Comprimento de

onda 220 nm 220 nm

3.3 Ensaios de atividade antimicrobiana

Após a obtenção dos peptídeos, estes foram avaliados em relação a sua

atividade antimicrobiana. O método empregado neste trabalho para a obtenção dos valores de concentração inibitória mínima (CIM) foi o de diluição em microplacas (LIU et

al., 2007). Os ensaios foram realizados em colaboração com o grupo de pesquisa da

professora Dra. Tais Baub, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista (UNESP).

3.3.1 Atividade antibacteriana

Para a determinação da CIM os ensaios consistiram na incubação das bactérias

(Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 25923) com uma

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dímeros) dos peptídeos em microplacas esterilizadas de 96 poços (Costar microtiter plate) em um volume final de 100 μL, compostos de 50 μL da cultura bacteriana e 50 μL de peptídeo dissolvido em água. A quantidade inicial de bactéria foi aproximadamente 1

x 107 UFC/mL. Como controle da ausência de proliferação bacteriana, incubou-se o

antibiótico ciprofloxasacina com a suspensão bacteriana. Os controles de meio de cultura (Muller-Hinton) e de solvente (água) também foram realizados. A inibição do crescimento foi determinada visualmente com ajuda de resazurina, após incubação por 20 h a 37°C. O ensaio foi realizado em duplicata.

A concentração bactericida mínima (CBM) foi determinada semeando uma pequena quantidade dos poços das microplacas do ensaio anterior sobre placas de Agar Mueller-Hinton. As mesmas foram incubadas a 37ºC por 24 h e a presença ou ausência de colônias foi avaliada.

3.3.2 Atividade antifúngica

Para a determinação da CIM, os ensaios consistiram na incubação da levedura (Candida albicans ATCC 18804) com uma diluição seriada dos PAMs (250 a 0,125

μg/mL). A quantidade inicial de levedura foi aproximadamente 1 x 105 UFC/mL. A

inibição do crescimento foi determinada visualmente com ajuda de Cloreto de Trifenil Tetrazolio (TTC) após incubação por 48 h a 37°C. Os controles negativos e positivos foram obtidos com fluconazol e meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI), respectivamente. O ensaio foi realizado em duplicata.

A concentração fungicida mínima (CFM) foi determinada retirando-se alíquotas de cada poço das placas do ensaio anterior e colocando-as em novas placas com meio de cultura estéril durante 24 h de incubação a 37ºC avaliando a presença ou ausência de colônias.

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3.4 Curva de viabilidade bacteriana

A cinética de morte celular de E. coli foi avaliada utilizando o dobro da CIM, seguindo como base o protocolo descrito por Zhu e Shin (2009). A quantidade inicial de

bactéria foi aproximadamente 1 x 106 _{UFC/mL. Depois de 0, 10, 20, 30, 40, 60 e 80}

minutos de contato com os peptídeos a 37 o_{C, aliquotas de 20 µL foram diluídas}

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o Müeller-Hinton (MH) agar e incubadas a 37o_{C por 24 h. O controle foi realizado em}

ausência de peptídeo, tomando amostras no começo e fim do teste. O ensaio foi realizado em duplicata.

3.5 Ensaio de atividade hemolítica

O protocolo foi modificado de Onuma et al. (1999). Hemácias de sangue humano foram separadas do plasma por centrifugação e lavadas 3 vezes com tampão PBS (35 mmol/L fosfato de sódio; 0,15 mol/L de cloreto de sódio) pH 7,4. Uma suspensão celular a 2 % (v/v) e diluições seriadas dos peptídeos foram usadas na determinação da

concentração hemolítica que lisa 50% das hemácias (HC50) (volume final 200 μL: 100

μL da solução diluída do peptídeo e 100 μL da suspensão celular).

Depois da incubação a 37ºC por 1 h, os tubos foram centrifugados a 3000 rpm por 5 min e alíquotas de 100 μL do sobrenadante foram pipetadas em microplacas de 96 poços. A absorbância a 405 nm foi determinada usando leitor de microplaca (BioTek, modelo Epoch). O valor de 100% de hemólise foi determinado utilizando 100 μL da suspensão celular misturada com 100 μL de Triton X-100 1% (v/v), enquanto que o valor de 0% de hemólise obtido utilizando 100 μL da suspensão celular com 100 μL de tampão PBS. O ensaio foi realizado em duplicata.

3.6 Determinação do tamanho do poro:

Para determinar o tamanho do poro formado pelos peptídeos foi utilizado o protocolo de Zaragoza et al. (2010) com as correspondentes modificações. Uma solução de hemácias (preparada da mesma forma que para o teste de atividade hemolítica) contendo 30 mmol/L de diferentes protetores osmóticos foi colocada em contato com o peptídeo em estudo (MON ou DSE) e a porcentagem de hemólise em presença dos diferentes protetores osmóticos foi determinada (da mesma forma que para o teste de atividade hemolítica). Os seguintes protetores foram utilizados: PEG200 (diâmetro meio ≈0,9 nm); PEG300 (≈1,2 nm); PEG400 (≈1,4 nm); PEG600 (≈1,5 nm); PEG900 (≈1,7 nm); PEG1000 (≈1,8 nm); PEG1500 (≈2,4 nm); PEG3000 (≈3,0 nm) e PEG4000 (≈3,8 nm). O teste foi realizado em triplicata.

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3.7 Estudos de permeabilização

Devido aos eritrócitos conterem uma maior quantidade de esfingomielina (SM) e as bactérias Gram-negativas de dipalmitoil-fosfoetanolamina (DPPE), resolvemos estudar comparativamente a influência desses lipídeos na interação com os peptídeos. Dessa forma, dois tipos de vesículas diferentes foram confeccionadas seguindo o protocolo de Crusca et al., (2010): dipalmitoil- fosfatidilcolina (DPPC), ácido dipalmitoil- fosfatídico (DPPA) e SM na razão de 80%, 5% e 15%, respectivamente, e DPPC, DPPA e DPPE na mesma proporção. Para esses estudos, soluções-estoque concentradas das vesículas (15 mmol/L) foram preparadas. DPPA foi utilizado por apresentar carga negativa, mimetizando assim o potencial eletroquímico das membranas, enquanto que DPPC foi usado por não ser possível experimentalmente preparar vesículas de DPPE acima de 15%.

Os lipídeos pesados na proporção acima descrita foram dissolvidos em uma

solução de clorofórmio:metanol (4:1), a qual posteriormente foi evaporada em N2 até

formar um filme fino aderido na parede do tubo. Esse filme foi mantido sob vácuo durante 12 h para eliminação total dos solventes. Posteriormente, o filme foi hidratado com uma solução de carboxifluoresceína (CF) 80 mmol/L, formando vesículas multilamelares (MLVs).

Durante uma hora, o filme foi submetido repetidamente a um banho a 60ºC, vortex e ultra-som, para que as camadas fossem quebradas e o tamanho das vesículas diminuídas. Para obter as vesículas unilamelares grandes (LUVs), as MLVs foram submetidas a um extrusor, contendo um filtro de policarbonato com poros de 100 nm de diâmetro (Avanti Polar Lipids). Para a homogeneização do tamanho das vesículas foram realizados 40 ciclos de extrusão.

A CF não incorporada às vesículas foi removida por filtração em gel em uma coluna Sephadex G-50 (Amersham Biosciences) estabilizada com tampão Tris-HCl 0,01 M, NaCl 0,15 M pH 7,4.

Nos estudos foi utilizado um espectrofotômetro de fluorescência Cary Eclipse VARIAN, em 492 nm e 517 nm de excitação e emissão, respectivamente. O valor de 100% de permeabilização foi obtido pela adição do Triton x-100. Esse detergente provoca a lise total das vesículas e a liberação da CF, que pode ser observada pelo aumento da intensidade de fluorescência. As análises foram realizadas por triplicata a 25ºC em tampão Tris-HCl 0,01 mol/L, NaCl 0,15 mol/L pH 7,4.

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Devido à instabilidade das vesículas, a suspensão de LUV foi usada até no máximo 24 h após a sua preparação e armazenada a 4°C. Os estudos foram realizados em triplicata.

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3.8 Ensaios de dicroísmo circular

Os espectros de CD foram adquiridos em um espectropolarímetro Jasco J-715, em celas de 1,0 mm de caminho óptico com 4 varreduras por espectro com tempo de integração de 3 s por ponto. Para todos os experimentos a leitura foi feita a cada 0,5 nm. Os estudos de CD foram realizados no Instituto de Física de São Carlos - Universidade de São Paulo-USP, no grupo de Biofísica Molecular “Sérgio Mascarenhas”. Nesse estudo foram preparadas soluções estoques dos diferentes peptídeos em água, para posterior diluição a 60 µmol/L em solução aquosa, e diferentes concentrações de lisofosfatidilcolina (LPC).

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