8. Strategisk rentabilitetsanalyse
8.4 Finansieringsfordel
Já que os resultados de velocidade bactericida e a atividade hemolítica foram diferentes entre o monômero e os dímeros, resolvemos avaliar se o mecanismo de ação era o mesmo para estes dois tipos de moléculas.
Recentes trabalhos (IMURA; CHODA; MATSUZAKI, 2008) mostraram que o PAM magainina apresenta diferentes modos de permeabilização em diferentes membranas (procariota e eucariota), com tamanhos de poro também diferentes. Nesse sentido, achamos interessante avaliar se a maior atividade bactericida e hemolítica dos dímeros está relacionada a diferente mecanismo de ação. Visando atingir esse objetivo, o teste de proteção osmótica foi realizado. Esse utiliza moléculas de diâmetro hidrodinámico conhecido que podem, em função dessa variável, entrar ou não nas hemácias através dos poros formados pelos peptídeos. Se não conseguirem, é porque o tamanho do poro é menor que o diâmetro da molécula osmo-protetora, e a ação hemolítica do peptídeo é inibida, já que a pressão osmótica fica balanceada.
Na figura 30 pode-se observar que enquanto os PEGs 200, 300 e 400 não apresentaram nenhum efeito na atividade hemolítica dos peptídeos, uma diminuição foi
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observada quando PEGs de maiores tamanhos foram utilizados. Esse teste mostra
claramente que, para os peptídeos avaliados, os poros apresentam diâmetros (dporo) de
1,4 a 1,5 nm, isto é, o mesmo valor. Estes resultados indicam mecanismo de ação similar para estes dois peptídeos.
Figura 30: Efeito dos protetores osmóticos sobre a hemólises induzida pelo MON ( ) e DSE ( ) em 80 e 1,2 µmol/L, respectivamente.
Assumindo que o diâmetro de uma α-hélice (dα-hélice) é 1 nm (SPAAR;
MÜNSTER; SALDITT, 2004), pode-se estimar o número de peptídeos que formam o poro (n) dividindo o perímetro dele pelo diâmetro da α-hélice. Considerando que a circunferência do poro passa pelo centro dos peptídeos (figura 31), n pode ser obtido utilizando a seguinte fórmula:
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Figura 31: Modelo geométrico simples, representando os peptídeos formando o poro. A: diâmetro do poro (experimental); B: diâmetro do poro (teórico); C: diâmetro da α-hélice.
Foi possível determinar assim, que o poro é formado por 6 moléculas monoméricas ou 3 diméricas.
4
4.7 Estudos de permeabilização
Devido à diferença obtida na atividade hemolítica e antimicrobiana entre o monômero e o dímero, este bloco teve como finalidade obter um melhor entendimento destas diferenças. Desse modo, dois tipos de vesículas contendo DPPA e DPPC foram confeccionadas. DPPA foi utilizado por apresentar carga negativa, mimetizando assim a carga negativa das membranas, enquanto que DPPC foi usado por motivos experimentais previamente descritos. Devido aos eritrócitos conterem uma maior quantidade de SM e as bactérias Gram-negativas de DPPE, resolvemos estudar comparativamente a influência desses lipídeos na interação com os peptídeos.
A figura 32 mostra o perfil de liberação de carboxifluoresceína (CF) dos
peptídeos. Claramente, pode-se observar a maior capacidade e velocidade de permeabilização dos dímeros, quando comparados com o monômero, especialmente em vesículas contendo esfingomielina. A porcentagem máxima de permeabilização e o tempo necessário para alcançar 50% de liberação estão apresentados na tabela 9. É interessante observar que a velocidade de permeabilização está diretamente relacionada com os resultados obtidos no ensaio de atividade biológica.
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a b
Figura 32: Liberação da carboxifluoresceína em vesículas de DPPA:DPPC:DPPE (a) e DPPA:DPPC:SM (b) para 0,01 umol/L de peptídeos em função do tempo.
Para avaliar o efeito de igualar a quantidade de cadeias na capacidade e velocidade de permeabilização dos peptídeos, a concentração do monômero foi
duplicada. Esses ensaios mostraram que a duplicação da concentração de monômero
não é suficiente para atingir a capacidade de permeabilização dos dímeros, confirmando que a proximidade das cadeias é um fator importante na atividade deste peptídeo.
Os resultados obtidos não mostraram diferenças significativas entre os dímeros.
Tabela 10 Porcentagens e tempo de permeabilizacao dos peptídeos
DPPA/DPPC/SM DPPA/DPPC/PE Peptídeo/Conc.
(µmol/L) Perm. % T50% (min) Perm. % T50% (min)
MON/0.01 6 - 46 4,11
MON/0.02 74 0,36 97 0,32
DSE/0.01 97 0,08 96 0,11
DEP/0.01 95 0,08 98 0,12
DEA/0.01 95 0,08 93 0,11
% Perm.: porcentagem de permeabilização.
T50: tempo necessário para atingir 50% da intensidade máxima.
4
4.8 Ensaios de dicroísmo circular
O conhecimento das estruturas secundárias de moléculas como proteínas e peptídeos são cruciais para entender a relação entre a função e a atividade dessas moléculas de grande interesse biológico. Em tal sentido o efeito da dimerização e das características dos espaçadores na estrutura dos peptídeos sintetizados foi avaliada.
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Os resultados, apresentados na figura 33, revelaram que em solução aquosa os peptídeos não apresentaram uma estrutura secundária definida, enquanto que na presença de micelas de lisofosfatidilcolina adquiriram uma estrutura em α-hélice.
Figura 33: Espectros de DC dos peptídeos em solução aquosa (a) e micelas de LPC (b). Espectropolarímetro Jasco J-715, com celas de 1,0 mm de caminho óptico; 4 varreduras por espectro com tempo de integração de 3 s por ponto; leitura a cada 0,5 nm.
Também é interessante observar que o conteúdo de α-hélice não foi significativamente alterado pela dimerização nem pelas características dos espaçadores.
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5 CONCLUSÃO
Um PAM na forma monomérica e três diméricas com diferentes espaçadores foram sintetizados pelo método de SPFS utilizando uma combinação das químicas Fmoc e Boc. A síntese se mostrou difícil, sendo necessário o uso de resinas com baixo grau de substituição ou contendo PEG em sua estrutura. Análises por cromatografia de fase reversa e espectrometria de massas confirmaram o sucesso das sínteses e das purificações.
Os ensaios de atividade antimicrobiana, em termos de CIM mostraram que a dimerização não afetou significativamente a capacidade do peptídeo de inibir o crescimento de bactérias e fungos, isto é, as atividades obtidas para os dímeros foram semelhantes as do monômero. Quando os dímeros são comparados entre si, uma maior capacidade microbicida foi encontrada para o dímero contendo o espaçador polar.
A atividade hemolítica dos peptídeos também foi avaliada, encontrando-se uma diferença muito significativa, aproximadamente 50 vezes maior para os dímeros. Os resultados obtidos mostraram que a dimerização afeta seletivamente a atividade biológica desse peptídeo, aumentando a atividade hemolítica sem afetar significativamente a atividade antimicrobiana e a estrutura, indicando a possibilidade do mecanismo de ação ser diferente nestes dois sistemas (micro-organismos e hemácias). Esse tipo de observação também foi encontrado com outros peptídeos (IMURA; CHODA; MATSUZAKI, 2008; CRUSCA et al., 2010). Essa diferença também pode ser explicada em termos da composição de membranas, especificamente a presença de moléculas como lipopolisacarídeos que podem influenciar o processo de interação e formação de poros. Com o objetivo de tentar explicar essa diferença sob outro ponto de vista, o teste de proteção osmótica foi realizado, mas o tamanho dos poros resultou semelhante, o que não permitiu explicar as diferenças em termos do mecanismo de ação. Conhecendo o diâmetro dos poros, foi possível inferir o n (número de moléculas que formam o poro). Acreditamos que os poros são formados por 6 moléculas monoméricas ou 3 díméricas.
Estudos de permeabilização mostraram que a porcentagem máxima de permeabilização e a velocidade de liberação de carboxifluoresceína foram maiores para os dímeros quando comparados com o monômero, especialmente em vesículas contendo esfingomielina. Esses resultados estão de acordo com os testes de atividade
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biológica discutidos acima. Além disso, é importante ressaltar que utilizando o dobro da concentração de monômeros, o que iguala o número de cadeias peptídicas em relação ao dímero, a capacidade de permeabilização dos dímeros ainda foi maior, o que mostra que a proximidade das cadeias é um fator importante na atividade desse peptídeo.
Os dados de velocidade de atividade antimicrobiana mostraram que os dímeros matam a bactéria E. coli em um tempo menor que o monômero. Esses dados indicaram que a etapa limitante da formação dos poros, é aquela que envolve a agregação dos peptídeos.
Análises por dicroísmo circular revelaram que em solução aquosa os peptídeos não apresentam uma estrutura secundária definida, enquanto que em presença de
micelas de LPC apresentam uma estrutura em α-hélice, cujo conteúdo não foi
significativamente alterado pela dimerização.
Esses dados mostram que a dimerização de PAMs no desenvolvimento de novas moléculas ativas ainda não é um consenso, necessitando de estudos complementares para o entendimento do seu modo de ação.
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