Innledning ________________________________________________________ XIX 2.0. Læringsteori ________________________________________________________ II

A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2-DE) é uma técnica de separação largamente utilizada para a análise de misturas complexas de proteínas extraídas de células, tecidos ou outras amostras biológicas. Teoricamente, é capaz de resolver até 10.000 proteínas simultaneamente, no entanto ainda existem limitações que devem ser consideradas no momento do desenho experimental do projeto a ser executado.

Esta técnica promove a separação das proteínas em duas dimensões, de acordo com duas propriedades independentes: na primeira dimensão, focalização isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos (pI), ou seja, o pH no qual a carga global da proteína é nula; na segunda dimensão, eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), as proteínas são separadas de acordo com suas massas moleculares relativas.201 _{A Figura 3.1 apresenta um esquema do procedimento}

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Figura 3.1 - Esquema do procedimento realizado em eletroforese bidimensional (2-DE).

Fonte: Adaptado de CANTÚ, M. D. Análise proteômica diferencial aplicada para o estudo da morte súbita

dos citros. 2007. 229 f. Tese (Doutorado em Química Analítica) - Instituto de Química de São Carlos,

Universidade de São Paulo, São Carlos, 2007.202

As proteínas são macromoléculas de natureza anfótera, ou seja, apresentam características ácidas ou básicas dependendo do pH ao qual estão expostas. Portanto, em diferentes pHs elas apresentam estados de ionização distintos, adquirindo uma carga global que pode ser positiva, negativa ou neutra. A IEF das proteínas ocorre em um gradiente de pH e sob a aplicação de uma diferença de potencial, a partir da qual as proteínas migram até encontrarem o pH correspondente ao seu ponto isoelétrico, onde a carga é neutralizada. Atualmente o gradiente de pH é produzido pela técnica de gradiente de pH imobilizado (IPG) em fitas, nas quais ocorre copolimerização de derivados de acrilamida, cuja combinação em concentrações adequadas define o intervalo e a forma do gradiente de pH produzido.203 _Desta

forma, a IEF pode ser realizada em fitas de diversos comprimentos e com diferentes faixas de pH, o que permite otimizar a separação para cada tipo de amostra.

A segunda dimensão é realizada com as proteínas completamente desnaturadas e na forma linear, em géis de poliacrilamida. Estes géis são formados por ligações cruzadas entre a

115 acrilamida e a N'-N-metilenobisacrilamida, o que faz com que a estrutura do gel seja porosa, com os poros distribuídos ao longo de toda a matriz. O tamanho médio dos poros é determinado pelas porcentagens de acrilamida e bisacrilamida utilizadas, sendo que quanto maior a concentração de acrilamida menores serão os poros formados na matriz. A escolha da concentração do gel é um parâmetro de extrema importância para que uma boa separação seja obtida, e depende da faixa de massa molecular de interesse.

Antes do início da eletroforese a proteína desnaturada tem a sua carga intrínseca anulada para que a separação dependa apenas de sua massa molecular, o que é feito pela adição de dodecil sulfato de sódio (SDS). O SDS é um agente tensoativo aniônico que apresenta uma cabeça polar carregada negativamente e uma cauda hidrofóbica. O SDS desnatura as proteínas através da formação de um complexo micela-proteína (na razão 1,4 g SDS/1 g de proteína), que apresenta uma carga global negativa e constante por unidade de massa, fazendo com que a separação eletroforética no gel de poliacrilamida dependa basicamente da massa molecular da proteína.201 Após o balanço de cargas, a fita contendo as proteínas focalizadas é aplicada no topo do gel de poliacrilamida e uma diferença de potencial é aplicada entre as extremidades do gel fazendo com que as proteínas migrem em direção ao pólo positivo e sejam separadas em relação a suas massas moleculares.

Depois de realizada a separação eletroforética bidimensional, a visualização dos resultados é feita por meio da coloração do gel. Os métodos mais comumente empregados são as colorações com corantes orgânicos e prata.204 Os corantes orgânicos apresentam o método mais simples de coloração de proteínas, porém a sensibilidade da detecção varia de coloração para coloração, bem como de proteína para proteína. A maior parte dos corantes orgânicos são eletrostaticamente atraídos pelos grupamentos carregados das proteínas, formando fortes complexos corante-proteína. O corante orgânico mais utilizado é o Coomassie Blue, que na forma coloidal apresenta uma maior sensibilidade.205 O método de coloração com prata consiste na redução dos íons Ag+ a Ag0 em regiões específicas do gel, ocupadas pelas proteínas. A intensidade da coloração, como com corantes orgânicos, está relacionada à quantidade de aminoácidos básicos presentes na cadeia polipeptídica.205,206 A sensibilidade da coloração com prata é muito maior do que com Coomassie, no entanto apresenta problemas com a repetibilidade.

O maior alvo de críticas com relação a 2DE é a baixa reprodutibilidade e, em algumas ocasiões, também baixa repetibilidade, o que é de extrema importância em análise quantitativa, já que a quantificação relativa se dá pela comparação das imagens geradas

116 associando os spots dos géis de diferentes amostras com os de um gel “padrão”. Para aumentar a confiabilidade da quantificação é essencial que os géis comparados tenham boa qualidade de separação que possa ser reproduzida para todas as amostras. A polimerização da acrilamida e a formação das malhas reticulares do gel é dependente da concentração de acrilamida e de bisacrilamida, do pH, da temperatura, do oxigênio dissolvido e do tempo de polimerização. Pequenas variações nesses parâmetros influenciam a formação dos retículos fazendo com que as propriedades de separação do gel sejam suavemente deslocadas, interferindo na separação das proteínas.207 Além disso, o preparo da amostra é uma etapa muito importante na reprodutibilidade dos experimentos em 2-DE. Para a obtenção de géis com qualidade é necessário promover a solubilização, a desnaturação e redução das proteínas, eliminar os interferentes e, concomitante a essas etapas, evitar a degradação da amostra.

A variação entre géis pode ser minimizada na técnica de DIGE, que permite a comparação de proteínas de duas amostras em um único gel. Nesta técnica, as proteínas de duas amostras são marcadas separadamente com corantes fluorescentes, Cy3 ou Cy5, com diferentes comprimentos de onda de emissão e excitação, mas com massas relativas idênticas. Um padrão interno contendo quantidades iguais das duas amostras é marcado com Cy2 para normalização dos dados. As amostras marcadas são misturadas, sujeitas à eletroforese bidimensional no mesmo gel, e digitalizadas com diferentes lasers para detectar as proteínas em cada gel. As imagens são sobrepostas e normalizadas, sendo que somente as diferenças entre as amostras são observadas.208 Esta técnica permite a comparação diferencial da expressão de proteínas de amostras complexas em único gel, e resultados quantitativos com maior exatidão.