Analysis of Three Norwegian-Canadian Newspapers

4.4.1. Contigs NBS-LRR

As 260 seqüências geradas com primers para os R genes da familia NBS-LRR foram montadas em 38 contigs contendo o domínio NB-ARC, todos com ORFs completas codificando RGAs. O valor de N50 gerado para a montagem de contigs

52 NBS-LRR foi de 628, isto é, 50% dos contigs possuem mais que 628 pb. Proporcionalmente, o maior contig encontrado (c16) originou-se dos primers P1B- RNBS-D e 1F-P3B com um total de 23 seqüências provenientes exclusivamente do cultivar Calcutta 4. Tal resultado pode ser explicado, pois ambos os primers possuem o motivo GLPL que é uma rara variação do GSPL que se liga em um sítio mais distante, formando seqüências maiores. O mesmo ocorreu com o uso dos mesmos primers em outros trabalhos em Musa (MILLER, et al., 2008) e em Arachis (BERTIOLI et al., 2003).

Não foi possível observar uma padronização na organização dos contigs, referente ao cultivar de origem. Cerca de 60% possuem seqüências exclusivamente de um cultivar, enquanto os demais apresentam seqüências nos contigs originadas de diferentes cultivares.

O conjunto de primers que obteve maior eficiência em relação a amplificação de RGAs NBS-LRR, mostrando-se de forma bem distribuída nos contigs foi P1B-RNBS-D contrastando com 1F-P3B que se restringiu a poucos contigs (Gráfico 1).

Gráfico 1- Porcentagem de contigs composto de combinações específicos de primers para NBS-LRR

RGAs.

Dos 38 contigs NBS-LRR, 11 obtiveram predição de pseudogenes pelo programa Genewise (Gráfico2). Esses pseudogenes são recursos importantes para a genômica, pois fornecem registros moleculares de genes antigos que deixaram de existir (Zhang et al., 2004).

Gráfico 2 – Composição de Contigs gerados para a família de R genes NBS-LRR

Um número elevado de contigs obteve alta similaridade com seqüências de Musa, alinhando com mais de 70% de seqüências já depositadas no Genbank, com um total de sete genes putativos novos encontrados contendo os domínios NB-ARC (Tabela 9). Isso talvez reflita o volume de dados gerados em diversos trabalhos recentes explorando a diversidade de R genes da família NBS-LRR em Musa.

Tabela 9 – Lista de NBS-LRR contigs com hits no genewise para domínios conservados e predição de

pseudogenes, com respectivos cultivares e combinações de primers.

Contigs Domínio NB-ARC _Genewise Pseudogenes _Genewise Putativos novos _genes Cultivar Combinação de primers

c1 X C, P, N 3 c2 X X P, L 3 c3 X C, P, L 1 c4 X X P, N 3 c5 X X C, P 1 c6 X X C, P 3 c7 X C, P 1 c8 X C, N 2 c9 X P, N 3 s10 X C 2 lrc11 X x C, P 3 s12 X C 2 s13 X x C 1 s14 X x C 1 c15 X X C, P 3 c16 X C 1, 2 c17 X C, N 2 s18 X x L 1 c19 X x N, L 1 s20 X x L 1

54 s21 X L 1 s22 X N 2 s23 X N 3 s24 X N 3 s25 X N 1 s26 X N 3 s27 X x N 1 c28 X X P, N 3 s29 X x N 1 s30 X x N 1 s31 X P 3 c32 X P 3 s33 X P 3 s34 X P 3 s35 X P 3 c36 X X P 1 s37 X x P 1 s38 X P 1

Legenda: C = Calcutta 4; P = Pisang Berlin; N = Nyarma Yik; L = Lidi; 1 = P1B-RNBS-D; 2 = 1F-P3B; 3 = 3F2-13R1.

Os contigs gerados com sequências nucleotídicas foram submetidos à análises por blastx para identificação de domínios de interesse (NBS-LRR) e similaridades entre RGAs caracterizados neste trabalho e sequências de nucleotídeos não redundantes (nr) do Genbank. A tabela 10 mostra os resultados obtidos pelo blastx identificando hits com outras espécies, como por exemplo, arroz, uva, sorgo, além de diferentes espécies de Musa. O amplo espectro de diferentes sequências com hits apresentando alta similaridade pelo blastx confirma a conservação esperada dos domínios protéicos relacionados à resistência.

Tabela 10 – Análise das seqüências dos contigs por Blastx gerados com primers degenerados para a

família de genes de resistência NBS-LRR

Contigs Blast x acesso Blast x descrição Blast x e‐value

c1 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] 3E-63 c2 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] e-112 c3 gb|ABW96280.1| NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisiaca] 2E-82 c4 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] 4E-44 c5 emb|CAN67431.1| hypothetical protein [Vitis vinifera] 2E-31 c6 gb|EES18426.1| hypothetical protein SORBIDRAFT_09g024125 [Sorghum bicolor] 6E-36 c7 gb|ABY75801.1| resistance gene candidate NBS-type protein [Musa acuminata subsp. malaccensis] 3E-66 c8 gb|ACK44409.1| NBS resistance protein [Musa ABB Group] 2E-54 c9 gb|ABW96287.1| NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisiaca] 1E-47 s 10 emb|CAP66325.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group] 1E-44 l rc11 gb|ABA95328.1| NB-ARC domain containing protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 3E-40 s 12 emb|CAP66325.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group] 2E-51 s 13 gb|ABS82596.1| putative NBS-LRR protein [Dracaena marginata] 3E-39 s 14 gb|ABS82596.1| putative NBS-LRR protein [Dracaena marginata] 9E-40 c15 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] 6E-48 c16 emb|CAP66295.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa AAB Group] 4E-87 c17 emb|CAP66325.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group] 1E-67 s 18 ref|XP_002268199.1| PREDICTED: hypothetical protein [Vitis vinifera] 4E-38 c19 gb|ABS84870.1| putative NBS-LRR type disease resistance protein 4 [Musa acuminata] 1E-46 s 20 gb|ABS82599.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 7E-40 s 21 emb|CAP66295.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa AAB Group] 4E-85 s 22 emb|CAP66309.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa banksii] 2E-73 s 23 gb|ACK44406.1| NBS resistance protein [Musa ABB Group] 1E-41 s 24 gb|ABS82600.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 4E-39 s 25 gb|ABS82600.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 1E-34 s 26 gb|EER94092.1| hypothetical protein SORBIDRAFT_01g019500 [Sorghum bicolor] 3E-43 s 27 gb|ABS82596.1| putative NBS-LRR protein [Dracaena marginata] 1E-39 c28 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] 2E-47 s 29 gb|ABS82599.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 1E-35 s 30 emb|CAP66295.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa AAB Group] 2E-84 s 31 gb|ACK44406.1| NBS resistance protein [Musa ABB Group] 5E-41 c32 gb|ACF21695.1| NBS-type resistance protein RGC5 [Musa acuminata subsp. malaccensis] 9E-83 s 33 gb|ABS82600.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 4E-41 s 34 gb|EEE67685.1| hypothetical protein OsJ_25338 [Oryza sativa Japonica Group] 3E-45 s 35 gb|ACK44406.1| NBS resistance protein [Musa ABB Group] 6E-40 c36 emb|CAP66325.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group] 2E-51 s 37 gb|ABS82599.1| putative NBS-LRR protein [Sansevieria trifasciata] 3E-36 s 38 emb|CAP66295.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa AAB Group] 3E-87

O alinhamento múltiplo realizado pelo programa MUSCLE utilizando seqüências protéicas de 7 RGAS derivadas de primers direcionados à família de R genes NBS-LRR, juntamente com seqüências de outros RGAs caracterizados em Musa pertencentes a esta família revelou que a maioria destas proteínas são altamente conservadas em bananas (Figura 15 ).

56 NBS LRR c15 1

Disease resistance protein NBS-LRR type [Musa acuminata] emb|CAD58967.1| NBS-LRR type disease resistance protein [Musa acuminata]gb|ABB96971.1| NBS_LRR_c4_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca] gb|ABW96286.1| NBS_LRR_c36_1

NBS-LRR type disease resistance protein 3 [Musa acuminata]gb|ABS84869.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group]emb|CAP66325.1 NBS-LRR type disease resistance protein 4 [Musa acuminata]gb|ABS84870.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa banksti]emb|CAP66309.1 NBS_LRR_c5_1

NBS_LRR_c15_1 NBS_LRR_c28_1 NBS_LRR_c6_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca]gb|ABW96287.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa velutina] emb|CAP66293.1|

NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. burmannicoides]emb|CAP66270.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata AAA Group]emb|CAP66334.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group]emb|CAP66327.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group]emb|CAP66331.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa balbisiana]emb|CAP66360.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata AAA Group]emb|CAP66333.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. malaccensis]emb|CAP66319.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. errans]emb|CAP66306.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. malaccensis]emb|CAP66321.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata AAA Group]emb|CAP66272.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa ABB Group]emb|CAP66389.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata]emb|CAP66335.1| Truncated NBS_LRR disease resistance protein [Musa schizocarpa] emb|CAP66391.1 NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. siamea]emb|CAP66308.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. malaccensis]emb|CAP66347.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa textilis x musa ABB Group]emb|CAP66318.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. microcarpa]emb|CAP66350.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa acuminata subsp. microcarpa]emb|CAP66353.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa balbisiana]emb|CAP66314.1|

NBS-LRR disease resistance protein [Musa banksii]emb|CAP66310.1| NBS_LRR_c2_1

NBS-LRR disease resistance protein [Musa ornata]emb|CAP66288.1|

57 NBS LRR c15 1

Disease resistance protein NBS-LRR type [Musa acuminata] emb|CAD58967.1| NBS-LRR type disease resistance protein [Musa acuminata]gb|ABB96971.1| NBS_LRR_c4_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca] gb|ABW96286.1| NBS_LRR_c36_1

NBS_LRR_c15_1 NBS_LRR_c28_1 NBS_LRR_c6_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca]gb|ABW96287.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa velutina] emb|CAP66293.1|

NBS-LRR disease resistance protein [Musa banksii]emb|CAP66310.1| NBS_LRR_c2_1

NBS-LRR disease resistance protein [Musa ornata]emb|CAP66288.1|

gdgdfgdg

Figura 15 – Alinhamento MUSCLE de sequências de RGAs de banana, mostrando parte da região conservada de NBS. (I, P-loop; II, quinase 2 e III, GLPL)

NBS LRR c15 1

Disease resistance protein NBS-LRR type [Musa acuminata] emb|CAD58967.1| NBS-LRR type disease resistance protein [Musa acuminata]gb|ABB96971.1| NBS_LRR_c4_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca] gb|ABW96286.1| NBS_LRR_c36_1

NBS_LRR_c15_1 NBS_LRR_c28_1 NBS_LRR_c6_1

NBS-LRR class resistance protein [Musa x paradisíaca]gb|ABW96287.1| NBS-LRR disease resistance protein [Musa velutina] emb|CAP66293.1|

NBS-LRR disease resistance protein [Musa banksii]emb|CAP66310.1| NBS_LRR_c2_1

NBS-LRR disease resistance protein [Musa ornata]emb|CAP66288.1|

59 A conservação do domínio NBS pode ser observada na figura 15, no qual em I se encontra a região P-loop logo no início da sequência, caracterizado pela presença de aminoácidos GKT. A conservação se mantém no motivo quinase 2 em II, com a presença de aminoácidos DVKW e, a presença do motivo GLPL mais ao final mostrado em III.

Para a construção da árvore filogenética foram utilizados 200 caracteres de sequências de proteínas de resistência NBS-LRR de Musa, dos quais 21 variaram, sendo que somente 158 foram informativos para parcimônia. As seqüências obtidas abrangeram os motivos P-loop, Quinase 2 e GLPL do domínio NBS. As 20.000 árvores mais parcimoniosas obtiveram valores de CI = 0, 759; RI = 0, 790; RC = 0,600; HI = 0,241.

Um nível significante de diversidade foi observado, com um total de 3 clados, denominados neste estudo de A, B e C, sendo que dentro do clado A estão os clados restantes. Esta variabilidade já foi prevista para sequências non-TIR NBS-LRR (MICHELMORE, 1998, MILLER et.al., 2008) Os RGAs identificados neste trabalho analisados juntamente com RGAs caracterizados em outras espécies de Musa podem ser agrupados em vários clados, confirmando que as sequências de Musa são divergentes, indicando a presença de uma família diversa que codifica proteínas com domínio NBS- LRR (Figura 16).

Figura 16 – Árvore consenso derivada da análise de máxima parcimônia englobando a região conservada

NBS entre os motivos P-loop, Quinase 2 e GLPL. As letras A, B e C correspondem aos clados formados

C B

61 Sequências protéicas NBS_LRR de M. acuminata (CAD58967.1 e ABB96971.1) surgem próximas ao contig NBS_LRAAc15 atuando como grupo externo. Subsequente à NBS_LRR de M. acuminata (CAD58967.1 e ABB96971.1) encontra-se o clado A, que, apesar de possuir baixa resolução interna, é bem suportado com considerável índice de suporte (> 50% bs) e composto por variadas sequências tanto de M. acuminata, quanto de Musa velutina, M. balbisiana, Musa textilis, Musa schizocarpa, Musa ornata e Musa banksii, além de diferentes subespécies de M. acuminata. O clado B apresenta sequências variadas e no clado C aparece o contig NBS_LRR_c2_1 muito próximo à proteína de resistência NBS-LRR de M. ornata (CAP66288.1) com elevado índice de suporte (> 90% bs), juntamente com sequências variadas de Musa.

4.4.2. Contigs RLK

As 371 seqüências geradas com primers para os R genes da familia de RLK foram montadas em 44 contigs, por meio do programa MIRA, contendo o domínio pQuinase. A predição das ORFs foi conduzida pelo software GENEWISE resultando em 65 ORFs completas, além de três ORFs interrompidas (C3, c7 e c14), com um valor de N50 = 408. As três seqüências foram subseqüentemente submetidas aos programas fGENESH e AUGUSTUS que confirmou ORF completa para os contigs c3 e c7. Não foi encontrada, de acordo com o programa, nenhuma predição de pseudogenes. Apesar de predita a ORF para os contigs c3 e c7, não houve predição de domínios conservados para as mesmas. Muitos dos contigs com números de seqüências consideráveis apresentaram exclusividade de um determinado cultivar, como é o caso dos contigs gerados pelos primers RLK_S4_K1_F/RLK_S4_ID_R, que formaram contigs exclusivamente para Calcutta4, Pisang Berlin, Nyarma Yik e Lidi. As seqüências geradas por este par de primer obtiveram hit no genewise com domínio LRR, diferentemente dos outros contigs que obtiveram hit com o domínio pQuinase (Tabela 12).

Tabela 11 - Lista de RLK contigs com respectivos hits no genewise para domínios conservados e

predição de duas ORFs por contig, com respectivos cultivares e combinações de primers.

Contigs Domínio Genewise Putativos novos _genes Predição de 2 _ORFs Cultivar Combinação de _primers

c1 x x C, P, N, L 5 c2 x x C, P, N, L 4, 2 c3 C, P 5, 4 c4 x x P, L 1 c5 x P 1 c6 x x P, N, L 2, 4, 5 c7 N, L 3 c8 x x N, L 2 c9 x C, P 4 c10 x N, L 2 c11 x x x C, P 1 c12 x P 2, 1 c13 x x x P 4 c14 P, N 2 s15 x x x N 3 s16 x x x N 1 s17 x x N 5 lrc18 x x x P, N 1 lrc19 x x x P, N 4 s20 x x x N 5 s21 x N 1 s22 x x x N 2, 4 s23 x x N 1 c24 x C, L 4 lrc25 x x x L 4 lrc26 x C, L 4 s27 x x L 4 lrc28 x x C, L 4 c29 x x P, L 4,2 s30 x x x L 2 c31 x x x C, L 2 s32 x x L 3 s33 x x x C 3 c34 x x C, P 2 s35 x x x C 3 lrc36 x x x C, P 4 s37 x x C 2, 4, 5 s38 x x x P 3 s39 x x x P 4 lrc40 x x x P 4 s41 x x x P 4

s42 x x x P 4

s43 x x x P 4

s44 x x x P 2,4

Legenda: C = Calcutta 4; P = Pisang Berlin; N = Nyarma Yik; L = Lidi; 1 = RLK_S1_K_F/RLK_S1_ID_R; 2 = RLK_S3_K_F/RLK_S3_ID_R; 3 = RLK_S4_K1_F/RLK_S4_ID_R; 4 = RLK_S4_K2_F/RLK_S4_ID2_R (a); 5 = RLK_S4_K2_F/RLK_S4_ID2_R (b).

O par de primers que obteve maior eficiência, mostrando-se de forma bem distribuída nos contigs foi RLK_S4_K2_F/RLK_S4_ID2_R (a), contrastando com as seqüências geradas pelo mesmo par de primer, porém com a banda de tamanho maior designada (b) (Tabela 12).

Tabela 12 – Eficiência dos combinações de primers na amplificação de RLK RGAs em Musa

O programa Genewise executou a predição de duas ORFs para 21 contigs (Tabela 6). Os contigs s23, s27, s32 e s37 são derivados do par de primer RLK_S4_K1_F/RLK_S4_ID_R, sendo os únicos a apresentar domínio LRR. Pelo fato de não possuírem domínio pQuinase, essas seqüências foram excluídas da análise filogenética.

A família de R genes para qual os primers degenerados foram direcionados (RLK) codifica um receptor quinase da mesma forma que a família STK. Este fato ocasionou na amplificação de produtos pertencentes às duas famílias de R genes e RGAs. A análise por Blast possibilitou a elucidação, pelo menos em parte, da identificação das distintas famílias nos contigs originados (Tabela 13).

Combinação de Primers Domínio Total de _contigs

Contigs com similaridade a RGA Total de seqüências N° de sequências com similaridade a RGAs RLK_S1_K_F/RLK_S1_ID_R _{Quinase 8} ₆ ₄₄ ₂₈ RLK_S3_K_F/RLK_S3_ID_R _{Quinase 13} ₁₀ ₈₁ ₅₁ RLK_S4_K1_F/RLK_S4_ID_R _{LRR 6} ₄ ₁₂₀ ₇₇ RLK_S4_K2_F/RLK_S4_ID2_R (a) Quinase 21 20 92 62 RLK_S4_K2_F/RLK_S4_ID2_R (b) Quinase 6 5 55 55

Tabela 13 - Análise de Blastx para identificação das famílias gênicas.

Contigs Blast x acesso Blast x descrição Blast x e-value

c1 gb|EEE78472.1| predicted protein [Populus trichocarpa] 3,00E-45

c2 gb|EEE66826.1| hypothetical protein OsJ_23594 [Oryza sativa Japonica Group] 5,00E-38 c3 gb|EEF35946.1| Receptor protein kinase CLAVATA1 precursor, putative [Ricinus communis] 5,00E-14 c4 gb|EEF34951.1| serine-threonine protein kinase, plant-type, putative [Ricinus communis] 9,00E-38 c5 gb|ACI05894.1| kinase-like protein pac.x.5.4 [Platanus x acerifolia] 2,00E-36

c6 gb|EEF04116.1| predicted protein [Populus trichocarpa] 7,00E-49

c8 emb|CAO69161.1| unnamed protein product [Vitis vinifera] 1,00E-45

c9 gb|ABR68658.1| brassinosteroid receptor-like kinase Tg-55 [Musa acuminata] 5,00E-65

c10 gb|ACU18288.1| unknown [Glycine max] 1,00E-33

c11 gb|EEE96314.1| predicted protein [Populus trichocarpa] 3,00E-36

c12 gb|AAC49123.1| receptor kinase-like protein 9,00E-38

c13 gb|EEC76216.1| hypothetical protein OsI_13615 [Oryza sativa Indica Group] 3,00E-66

c14 gb|EEF10213.1| predicted protein [Populus trichocarpa] 2,00E-17

s15 gb|ABY59531.1| protein kinase-like resistance protein [Musa x paradisiaca] 8,00E-74 s16 gb|EAZ40356.1| hypothetical protein OsJ_24802 [Oryza sativa Japonica Group] 9,00E-52 s17 gb|ABY59531.1| protein kinase-like resistance protein [Musa x paradisiaca] 1,00E-72

lrc18 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-76

lrc19 gb|AAT96698.1| putative LRR-like protein kinase 4 [Musa acuminata] 3,00E-58 s20 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 4,00E-76 s21 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-49 s22 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 3,00E-43 s23 gb|EAY73225.1| hypothetical protein OsI_01100 [Oryza sativa Indica Group] 6,00E-68 c24 gb|EAY73225.1| hypothetical protein OsI_01100 [Oryza sativa Indica Group] 1,00E-66

lrc25 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-46

lrc26 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 3,00E-50

s27 gb|EAY73225.1| hypothetical protein OsI_01100 [Oryza sativa Indica Group] 2,00E-71 lrc28 gb|ACI05894.1| kinase-like protein pac.x.5.4 [Platanus x acerifolia] 2,00E-36 c29 emb|CAJ86404.1| OSIGBa0125M19.7 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] 6,00E-34 s30 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 1,00E-47 c31 gb|AAT96698.1| putative LRR-like protein kinase 4 [Musa acuminata] 2,00E-58 s32 gb|EAY73225.1| hypothetical protein OsI_01100 [Oryza sativa Indica Group] 6,00E-68

s33 gb|EEF35168.1| kinase, putative [Ricinus communis] 7,00E-51

c34 emb|CAJ86404.1| OSIGBa0125M19.7 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] 7,00E-35 s35 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 7,00E-73 lrc36 gb|EAZ40356.1| hypothetical protein OsJ_24802 [Oryza sativa Japonica Group] 5,00E-52 s37 gb|EAY73225.1| hypothetical protein OsI_01100 [Oryza sativa Indica Group] 2,00E-68

65 s38 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-57 s39 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 1,00E-70

lrc40 gb|EEF35168.1| kinase, putative [Ricinus communis] 3,00E-51

s41 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-60 s42 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 1,00E-62 s43 gb|ABX56569.1| protein kinase-like resistance protein [Musa acuminata] 2,00E-72

s44 gb|EEF35168.1| kinase, putative [Ricinus communis] 7,00E-52

Foi desenvolvido um múltiplo alinhamento de seqüências usando o programa MUSCLE, para a construção da árvore filogenética, conduzido com seqüências protéicas de 20 RGAS derivados de primers direcionados à família de R genes que codifica um receptor quinase, juntamente com seqüências de RLK de O. sativa e STK de Musa. Somente os RGAs representativos de cada clado formado a partir do método Neighbor-Joining foram utilizados nessa análise. Os demais não foram alinhados e conseqüentemente, não foram utilizados na análise filogenética por máxima parcimônia. O alinhamento revelou uma grande conservação entre as seqüências de RGAs identificadas nesse estudo e uma variação relativamente alta quando comparada às seqüências do Genbank (Figura 18).

66 RLK_STK_c2_1 RLK_STK_c1_1 RLK_STK_lrc18_1 RLK_STK_c13_1 RLK_STK_c13_1* RLK_STK_lrc19_1 RLK_STK_c31_1 RLK_STK_c31_1*

Receptor kinase-like protein [Oriza sativa] AAY32497.1 RLK_STK_c7

RLK_STK_c3

Receptor-like kinaseTg-34 [Musa acuminata]gb|ABR68656.1 Pto resistance protein candidateTg-12 [Musa acuminata] gb|ABR68650.1 Pto resistance protein candidateTg-6 [Musa acuminata] gb|ABR68647.1 Pto resistance protein candidateTg-67 [Musa acuminata] gb|ABR68652.1 Pto resistance protein candidateTg-4 [Musa acuminata] gb|ABR68646.1 Pto resistance protein candidateTg-13 [Musa acuminata] gb|ABR68651.1 RLK_STK_c6_1 RLK_STK_c8_1 RLK_STK_s35_1 RLK_STK_s41_1 RLK_STK_s22_1 RLK_STK_s42_1 RLK_STK_lrc40_1 RLK_STK_s44_1 RLK_STK_s11_1

67 RLK_STK_c2_1 RLK_STK_c1_1 RLK_STK_lrc18_1 RLK_STK_c13_1 RLK_STK_c13_1* RLK_STK_lrc19_1 RLK_STK_c31_1 RLK_STK_c31_1*

Receptor kinase-like protein [Oriza sativa] AAY32497.1 RLK_STK_c7

RLK_STK_c3

68 Para a construção da árvore filogenética (Figura 19) foram reunidos ao todo 236 caracteres de sequências de proteínas de resistência RLK de Oryza, de STK de Musa e as sequências originadas nesse trabalho. Destes, 58 variaram, sendo apenas 142 informativos para parcimônia. As seqüências obtidas abrangeram regiões de quinase. As 20.000 árvores mais parcimoniosas obtiveram valores de CI = 0, 810; RI = 0, 765; RC = 0,619; HI = 0,190.

Figura 18 – Árvore consenso derivada da análise de máxima parcimônia englobando a região conservada

quinase. As letras A, B e C correspondem aos clados formados.

A B

C B

69 A partir da análise de parcimônia obteve-se uma árvore filogenética (Figura 19) com resolução interna razoável, porém com bons índices de suporte. Dentro desta árvore podem ser observados um clado principal A, com dois pequenos clados internos B e C. O clado A é composto por sequências amplificadas nesse trabalho, juntamente com sequências RLK de de Oriza e STK de Musa. Todas as sequências de STK encontradas em Musa estão unidas em um sub-clado fortemente suportado (100% bs) e subsequentemente está o sub-clado C exclusivamente composto por sequências originadas nesse trabalho e também com alto índice de suporte (> 80% bs).

In document "From sod house to lefse house" : immigration, ethnicity, and the formation and reformulation of the Norwegian-Canadian identity in Western Canada (sider 44-53)