comercializadas, foram selecionadas as variáveis “densidades de bactérias aeróbias mesófilas” “densidades de E. coli” e “densidades de bolores e leveduras”, todas expressas em Unidades Formadoras de Colônias por grama (UFC/g).
4.3.7.1 Seleção dos pontos de coleta, plantas medicinais estudadas e número de amostras a serem analisadas
Para a seleção dos pontos de coleta, foram consultados através de abordagem direta consumidores presentes na área da feira livre. Para tanto, em todos os pontos de venda presentes na feira – independentemente do tipo de produto comercializado – um indivíduo (consumidor ou proprietário) foi questionado quanto ao hábito de aquisição de plantas medicinais na feira livre. Em caso positivo, foi pedido que identificasse qual o ponto de venda de sua preferência e quais espécies vegetais adquiria com maior frequência.
Com base nas informações prestadas, foram elencados os pontos comerciais mais procurados pelos usuários, respeitando-se o limite de 50% do total. A escolha deste percentual deveu-se ao fato de que na bibliografia pertinente, inexistiam dados que descrevessem a metodologia utilizada na definição do número de pontos de comercialização selecionados pelos respectivos pesquisadores em seus estudos.
O número de plantas medicinais testadas em cada ponto de venda, bem como o número de amostras coletadas de cada uma delas foi definido com base nas normas da
Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) para o estabelecimento de planos de amostragem e procedimentos para inspeção por atributos (ABNT, 1985; BRASIL, 2001). No presente estudo, adotou-se um plano amostral de duas classes, no qual as amostras são consideradas adequadas ou não ao consumo humano perante limites legais, descritos no subitem “cálculo e expressão dos resultados obtidos”. Neste contexto, adotou-se como amostra representativa n=5.
Assim, foram elencadas para estudo as cinco espécies vegetais mais citadas pelos consumidores, sendo testadas cinco amostras de cada uma delas. Desse modo, em cada ponto de comercialização selecionado para análise microbiológica, foi testado um total de 25 amostras, distribuídas conforme a Figura 17.
Fonte: dados do pesquisador.
Figura 17. Distribuição das amostras coletadas para análise microbiológica, por ponto de comercialização. Cx: ponto de comercialização número x; P1 – 3: planta medicinal eleita com
base na preferência dos consumidores; A 1 – 5: amostras analisadas de cada planta.
Em decorrência da fragmentação das plantas medicinais disponíveis, das dificuldades de acesso aos coletores originais (raizeiros) e por tratar-se de um estudo voltado à avaliação do risco sanitário decorrente de deficiências estruturais e comportamentais no comércio de produtos da medicina tradicional, optou-se pela não identificação taxonômica das amostras
testadas. A partir deste princípio, as plantas medicinais foram mencionadas ao longo do trabalho através do uso da sua denominação comercial.
4.3.7.2 Coleta das amostras
Em cada ponto de comercialização selecionado como alvo das análises microbiológicas, as coletas foram realizadas semanalmente. Foram consideradas como amostras válidas as unidades que estivessem expostas ou armazenadas sob as condições normais presentes no ponto de venda.
Visando reproduzir as condições de comercialização vigentes no cotidiano da feira, as amostras foram selecionadas e embaladas pelo próprio comerciante, que empregou os materiais e procedimentos normalmente utilizados em sua prática diária. O material embalado foi posteriormente acondicionado em recipientes herméticos e estéreis, identificados por etiqueta contendo as seguintes informações: código da amostra, data e hora da coleta, espécie coletada e identificação do fornecedor e nome do coletor. As amostras embaladas pelo comerciante foram posteriormente acondicionadas em caixa isotérmica e imediatamente conduzidas às instalações do Laboratório de Microbiologia de Alimentos/Biologia Molecular (MicroBio) do IFRN/Campus Currais Novos, onde foram analisadas.
Para a detecção e quantificação dos indicadores microbianos selecionados como microrganismos-alvo das nossas análises, foram adotados os protocolos descritos na Instrução Normativa n°62 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003b) e Rocha et al. (2013c).
4.3.7.3 Análises microbiológicas a) Diluições decimais seriadas
A alíquota de 25g da amostra foi suspensa por agitação em 225 mL de solução salina peptonada estéril (pH 7,0), obtendo-se a diluição correspondente a 10-1. A partir desta, 1 mL foi transferido para tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina peptonada estéril, homogeneizando-se em agitador tipo vórtex, diluindo-se até 10-2. A operação foi repetida até obter-se a diluição correspondente a 10-8, em concordância com a carga microbiana esperada para o órgão vegetal testado.
b) Quantificação da densidade total de bactérias aeróbias mesófilas: contagem direta em placa
A partir de cada diluição, a alíquota de 0,1 mL foi individualmente semeada em superfície (spread plate) em duplicatas de placas de Petri contendo cerca de 15 mL de ágar Padrão de Contagem (PCA). As placas devidamente identificadas foram incubadas em posição invertida em estufa bacteriológica a 35°C±2°C/24±2h.
c) Quantificação das densidades populacionais de E. coli: contagem direta em placa A semeadura foi realizada em profundidade (pour-plate). A alíquota de 1 mL de cada diluição foi transferida individualmente para duplicatas de placas de Petri às quais posteriormente adicionou-se cerca de 16 mL de ágar MUG-VRB (46°C). Movimentos circulares suaves foram realizados, objetivando a completa homogeneização da amostra no ágar fundido. Após a solidificação, adicionou-se uma sobrecamada do mesmo ágar, de modo a prevenir o crescimento descontrolado de colônias superficiais (“espalhamento”). Posteriormente, as placas foram incubadas em posição invertida a 35±2°C/24 horas. A confirmação da presença de E. coli foi realizada através de fluorescência sob luz UV de ondas longas (366 nm).
d) Quantificação das densidades populacionais de bolores e leveduras: contagem direta em placa
A partir de cada diluição, a alíquota de 0,1 mL foi individualmente semeada em superfície (spread plate) em duplicatas de placas de Petri contendo cerca de 15 mL de ágar Batata-Dextrosado acidificado com ácido tartárico (10%). Posteriormente, as placas foram incubadas em posição normal a 25°C±2°C/5 dias.
e) Leitura e cálculo dos resultados
Para a Contagem Direta em Placa, foram consideradas as placas que continham entre 25 e 250 colônias, desde que pertencentes a uma sequência de diluições consecutivas. Caso isto não tenha sido possível, foram adotados os procedimentos para contagem em casos especiais descritos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2003b).
As colônias foram quantificadas com a utilização de um contador de colônias, com capacidade de ampliação correspondente a duas vezes, dotado de sistema digital de contagem. Os resultados foram registrados, para posterior cálculo das densidades microbianas observadas.
No cálculo das densidades, o resultado final foi expresso em Unidades Formadoras de Colônias por grama (UFC/g), levando-se em conta a diluição empregada, conforme a equação 10.
DO = Cx x ID (10)
DO = Densidade populacional observada do indicador testado Cx =contagem da placa da placa X
ID = Inverso da Diluição empregada.
No caso das análises conduzidas com semeadura em superfície (spread plate) o resultado final foi multiplicado por 10, considerando-se que o volume inoculado corresponde a 0,1 mL. No caso de semeadura em profundidade (pour-plate), tal procedimento não foi adotado por tratar-se da inoculação de uma alíquota com volume 10 vezes maior que a empregada na semeadura em superfície.
Como resultado, foram considerados os dois primeiros algarismos representativos, separados por vírgula. Os algarismos subsequentes, quando presentes, foram arredondados e transformados em potência de 10. Para os casos aqui omissos, foram consultados os procedimentos especiais de contagem e expressão de resultados contidos na RDC 62/2003 (BRASIL, 2003b). Em todos os casos, o resultado final foi expresso em Unidades Formadoras de Colônias por grama (UFC/g).
Para a adoção dos limites de adequação ou não ao consumo por humanos das plantas medicinais testadas, foram consideradas como formas de preparo os processos extrativos a quente (chás) e a frio (macerações). Para tanto, na ausência de parâmetros específicos para plantas medicinais brutas comercializadas em feiras livres, foram adotados os limites estabelecidos na RDC n°10, de 9 de março de 2010, que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais junto à ANVISA (BRASIL, 2010b), conforme Quadro 9.
Quadro 9. Densidades Populacionais permitidas pela RDC n°10/2010 para a presença de bactérias aeróbias mesófilas, bolores e leveduras e E. coli em produtos derivados de plantas medicinais destinados ao uso interno (chás e macerações).
As amostras que apresentaram densidades superiores aos limites estabelecidos para ao menos um dos indicadores pesquisados, foram consideradas insalubres ao consumo humano na forma de uso cujo limite foi extrapolado (chá ou maceração).
Os resultados obtidos foram expressos na forma de percentuais de reprovação para o consumo por humanos, tanto para os chás, quanto para as macerações.
4.4 Seleção do Indicador Biológico mais adequado à caracterização das condições