Entre as 49 extremidades cromossômicas analisadas, observamos que algumas estão localizadas em “contigs” cromossômicos anotados como homólogos no site TriTryp. Foram encontradas extremidades de 12 contigs homólogos, enumerados na Tabela 5.
Figura 8. Mapeamento das extremidades cromossômicas identificadas in
silico nas bandas cromossômicas de T. cruzi. A. Mapeamento das
extremidades do “contig” TcChr25-S nas bandas cromossômicas separadas por PFGE. A esquerda está a hibridização do marcador 6pp gluconolactonase com as bandas V e IX do clone CL Brener e a direita apresentamos o mapa esquemático das extremidades cromossômicas Tel 18 e 19. Os genes XM_802850 e XM_800447 correspondem a marcadores internos dos “contigs” TcChr25-S e TcChr25-P. B. Mapeamento das extremidades dos “contigs” TcChr39-P e TcChr39-S nas bandas cromossômicas. A esquerda está a hibridização do marcador “Ankyrin” com a banda XVI do clone CL Brener e a direita apresentamos os mapas das extremidades cromossômicas Tel 21 e Tel 36.
A
V - IX - IX - V - IX - V - XM_802850 XM_800447 6pp fosfogluconolactase 640815 6Kb 703709 Tel 18 - TcChr 25-SB
Ankyrin XVI - Tel 36 - TcChr 39 S “Ankyrin” 1806201 1853998 Tel 21 - TcChr 39-P “Ankyrin” 1808447 1853149 4 Kb Repetição teloméricaRH“ retrotransposon hot -spot proteins Trans-sialidases
DGF-1 dispersed gene family - 1)
Retroelementos
Proteínas hipotéticas e outros RNA helicase / N-acetiltransferase
Tabela 5: "Contigs" cromossômicos homólogos contendo a repetição telomérica "Contig" cromossômico
(TriTryp)
extremidade cromossômica
localização da repetição telomérica no "contig" cromossômico (sequência depositada no banco de
dados) TcChr11-P Tel 22 extremidade 3' TcChr11-S Tel 03 extremidade 5' TcChr13-P Tel 39 extremidade 5' TcChr13-S Tel 34 extremidade 5' TcChr19-P Tel 46 interna TcChr19-S Tel 04 extremidade 3' TcChr21-P Tel 35 extremidade 5' TcChr21-S Tel 47 interna TcChr22-P Tel 05 extremidade 5' TcChr22-S Tel 23 extremidade 3' TcChr25-P Tel 6 extremidade 5' TcChr25-S Tel 19 extremidade 5' TcChr25-S Tel 18 extremidade 3' TcChr27-P Tel 24 extremidade 3' TcChr27-S Tel 48 interna TcChr34-P Tel 42 extremidade 5' TcChr34-S Tel 12 extremidade 5' TcChr35-P Tel 13 extremidade 5' TcChr35-S Tel 25 extremidade 5' TcChr35-P Tel 40 extremidade 3' TcChr35-S Tel 38 extremidade 3' TcChr36-P Tel 20 extremidade 3' TcChr36-S Tel 26 extremidade 3' TcChr39-P Tel 21 extremidade 3' TcChr39-S Tel 36 extremidade 5' TcChr40-P Tel 15 extremidade 5' TcChr40-S Tel 44 extremidade 3'
Obs: as extremidades correspondentes à mesma região de "contigs" cromossômicos homólogos foram utilizadas em análises de sintenia
Decidimos analisar então se as extremidades de cromossomos homólogos mantinham a sintenia observada nas regiões intersticiais dos cromossomos. A quebra da sintenia é comum nas regiões subteloméricas de tripanossomatídeos (Ghedin, Bringaud et al., 2004), que não costumam manter a sintenia nos cromossomos homólogos como as regiões intersticiais. Para isso, utilizamos o programa ACT (Artemis Comparison Tool), disponível no site do Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/resources/software/act/). Este programa nos permite observar a sintenia entre os cromossomos, comparando as sequências dos “contigs” e fornecendo imagens com detalhes da análise. Algumas das extremidades cromossômicas se localizam no interior dos “contigs” cromossômicos (Tel 4λ, TcChr21-S; Tel 46, TCChr19-P), o que pode significar um erro no alinhamento dos “contigs” ou uma região de fusão telomérica. Por este motivo estas sequências foram excluídas destas análises, por não corresponderem a uma extremidade cromossômica de fato.
Por outro lado, algumas extremidades cromossômicas correspondem a regiões diferentes dos “contigs” homólogos (Tabela 5). Este fato foi observado nas extremidades Tel 22 (TcChr11-P) e Tel 03 (TcChr11-S), Tel 05 (TcChr22-P) e Tel 23 (TcChr22-S), Tel 24 (TcChr27-P) e Tel 48 (TcChr27-S) e Tel 15(TcChr40-P) e Tel 44 (TcChr40-S). Estas regiões também não foram analisadas, pois sua homologia não era esperada.
Sendo assim, analisamos extremidades dos pares de homólogos TcChr13-P (Tel 39) e TcChr13-S (Tel 34), TcChr25-P (Tel 6) e TcChr25-S (Tel 18), TcChr34-P (Tel 42) e TcChr34-S (Tel 12), TcChr35-P (Tels 13 e 40) e TcChr35- S (Tels 25 e 38), TcChr36-S (Tel 26) e TcChr36-P e TcChr39-P (Tel 21) e TcChr39-S (Tel 36). A figura 9 apresenta a análise da sintenia das extremidades dos cromossomos homólogos.
A B C D (3’) A TcChr 13-S Tel 34 TcChr13-P Tel 39 1 11741 20000 20000 10000 TcChr 25-P Tel 6 1 1 38268 40000 20000 20000 60000 TcChr25-S Tel 19 TcChr34-S Tel 12 TcChr34-P Tel 42 1 5564 102 20000 40000 60000 TcChr35-P Tel25 TcChr35-S Tel 25 1 1 19851 20000 40000 60000
D (5’)
E F
Figura 9. Análise da sintenia entre as extremidades cromossômicas de cromossomos homólogos de T. cruzi. Análises de sintenia entre as
extremidades dos “contigs” cromossômicos homólogos TcChr13-S e TcChr13- P (A); TcChr34-S e TcChr34P (B); TcChr25-S e TcChr25-P (C); TcChr35-S e TcChr35-P (D); TcChr36-S e TcChr36-P (E); e TcChr39-S e TcChr39-P (F). As linhas vermelhas representam regiões de homologia entre os dois “contigs”. Os genes anotados estão indicados na figura, no mapa da região subtelomérica.
1091011 TcChr35-P Tel 40 1141953 TcChr35-S Tel 38 1105311 1186845 TcChr36-S Tel 26 1114000 1180641 TcChr36-P Tel 20 1123196 1176121 TcChr39-P Tel 21 TcChr39-S Tel 36 1806000 1853998 1808000 1853149
As extremidades Tel 3λ e Tel 34, dos “contigs” homólogos TcChr13-P e TcChr13-S apresentam sintenia a partir da repetição telomérica iniciando com genes RHS e TS, mas em seguida a sintenia é quebrada pela inserção de alguns genes na extremidade Tel 39 (Fig. 9A). Após estes genes (RNA- helicase, N-acetiltransferase) se repete o gene RHS e é retomada a sintenia entre os dois “contigs”. É interessante observar que anterior ao gene RHS está o gene ESAG-like (“expression site associated genes”), inicialmente descrito em T. brucei e relacionado com a expressão de genes de proteínas de superfície deste parasita. Esta organização nos leva a crer que o gene RHS pode ter sido alvo de eventos de recombinação, que inseriram as sequências de quebra de sintenia na extremidade Tel 39.
Na figura 9C observamos que as extremidades dos “contigs” TcChr34-P (Tel 42) e TcChr34-S (Tel 12) são sintênicas nas repetições teloméricas, porém, após o primeiro gene (TS, comum às duas extremidades), a extremidade Tel 42 apresenta uma grande região que ainda não foi sequenciada, determinando uma aparente quebra na sintenia. Após esta região tem inicio a região intersticial do cromossomo, que possui homologia com o “contig” TcChr34-S (Tel 12). Neste caso, não é possível definir com certeza a sintenia entre as duas extremidades, pois, provavelmente a extremidade Tel 42 está incompleta. A maioria das extremidades teloméricas não apresenta similaridade com a extremidade presente no cromossomo homólogo. A figura 9B apresenta a análise de sintenia das extremidades Tel 6 e Tel 18 dos homólogos TcChr25-P e TcChr25-S. Podemos observar que a sintenia não foi mantida nestas regiões, apesar da presença de diversos genes das famílias RHS, DGF-1 e TS. O mesmo é observado na figura 9D, que apresenta a análise das extremidades Tel 13 e Tel 25, que formam as regiões 5’ dos cromossomos TcChr35-P e TcChr35-S, e as extremidades Tel 38 e Tel 40, que representam as regiões 3’. As figuras 9E e 9F mostram o mesmo padrão para os “contigs” cromossômicos homólogos TcChr36-P e TcChr36-S e TcChr39-P e TcChr39-S, com pouca sintenia na região subtelomérica, apesar da homologia entre as regiões intersticiais.
A ausência de sintenia nas regiões subteloméricas é mais um indício de que estas regiões estão sujeitas a diversos eventos de recombinação, o que aumenta a sua variabilidade, mesmo em cromossomos homólogos. A presença de genes típicos nestas regiões aumenta a chance ocorrerem eventos de recombinação, principalmente por mecanismos de recombinação homóloga ou de microhomologia (MMEJ), que utilizariam estas regiões para o pareamento e recombinação de extremidades livres.
4.2. Uso de cromossomos artificiais de T. cruzi na análise de