Regiões subteloméricas são definidas como a região localizada entre a extremidade telomérica e a primeira sequência interna (intersticial) típica do cromossomo (Barry, Ginger et al., 2003). Foram realizadas análises para definir e caracterizar as regiões subteloméricas de T. cruzi, identificando os genes comuns nesta região e o tamanho total da região subtelomérica, incluindo as repetições teloméricas.
Para isso analisamos uma região de 200 Kb dos “contigs” cromossômicos, partindo da repetição telomérica (quando os “contigs” possuíam tamanho igual ou superior a 200 Kb), observando-se todas as anotações gênicas. Com esta análise concluímos que os genes de proteínas RHS (“retrotransposon hot spot”), DGF-1 (“dispersed gene family-1”), trans-sialidases (TS), RNA-helicase, N-acetiltransferase e retroelementos repetitivos (VIPERs, SIREs) constituem as sequências mais abundantes nas proximidades dos telômeros. A tabela 2 apresenta os números de cópias destes genes encontradas nas extremidades cromossômicas e também o número total de sequências anotadas no projeto genoma de T. cruzi (El-Sayed, Myler et al., 2005).
Os genes RHS, DGF-1 e TS estão entre as famílias mais abundantes no genoma de T. cruzi, e já haviam sido identificados na região subtelomérica (Chiurillo, Cano et al., 1999; Kim, Chiurillo et al., 2005). Curiosamente, os genes de outras famílias extremamente abundantes como as mucinas e proteínas associadas a mucinas (MASPs) não foram encontrados frequentemente nas regiões analisadas. Apesar de presentes em todo o genoma do parasita, os genes das famílias RHS, DGF-1 e TS estão relacionados com as extremidades cromossômicas, respondem pela maior parte dos genes anotados nestas regiões e estão presentes na maioria dos “contigs” analisados. Aproximadamente λ,5 % dos genes de TS, 12% dos genes da família DGF-1 e 19% dos genes da família RHS anotados em T. cruzi foram encontrados nas extremidades cromossômicas analisadas (Tabela 2). Genes de RNA-helicase e N-acetiltransferase, não tão abundantes no genoma, também foram observados em diversas extremidades cromossômicas. As 14 cópias encontradas do gene da subunidade ARD1 do complexo da N- acetiltransferase representam 34% do total de cópias deste gene no genoma (41 cópias disponíveis no banco de dados TriTryp). A RNA-helicase dependente de ATP apresenta 17 cópias nos “contigs” analisados, de um total de 141 cópias disponíveis nos bancos de dados.
Tabela 2. Presença de genes nas extremidades cromossômicas de T. cruzi Produto gênico Número de cópias no genoma (pseudogenes) Número de cópias nas extremidades cromossômicas (pseudogenes) Porcentagem do total de cópias
proteínas de "Retrotransposon hot spot" (RHS) 752 (557)1 140 (95) 19%
trans-sialidases 1430 (693)1 127 (83) 9%
proteínas "Dispersed gene family 1" (DGF-1) 565 (136) 1 70 (17) 12%
RNA helicase 151 (141)2 19 (17) 12,5%
sub-unidade ARD-1 do complexo N-acetiltransferase 41 (38)2 14 (13) 34%
MASP 1377 (433)1 8 (7) 0,60%
Mucinas 863 (201)1 3 (2) 0,35%
1: Dados do projeto genoma de T. cruzi (El Sayed et al. , 2005) 2: Dados obtidos no site TriTrypDB (http://tritrypdb.org/tritrypdb/)
Hibridizações de sondas derivadas dos genes citados com as bandas cromossômicas separadas por eletroforese de campo pulsado (PFGE) comprovaram a presença destas sequências na maior parte das bandas cromossômicas (Fig. 6), comprovando a sua ampla distribuição pelo genoma do parasita.
Com os dados apresentados definimos as regiões subteloméricas dos “contigs” cromossômicos contendo a repetição telomérica. Consideramos as regiões subteloméricas, a partir da junção telomérica, regiões onde se encontram os genes típicos de telômero de T. cruzi (DGF-1, RHS, TS, RNA-helicase, N- acetiltransferase), se estendendo até a identificação de genes intersticiais. As regiões subteloméricas determinadas neste estudo possuem tamanho variável, sendo a menor de 5 Kb e a maior de 182 Kb (Tabela 1, Fig. 7).
Mapeamento in silico das regiões subteloméricas de T. cruzi
Uma vez definida, a região subtelomérica de cada uma das 49 extremidades cromossômicas foi cuidadosamente analisada. Inicialmente identificamos os primeiros genes anotados após a junção telomérica. Em 34 das 49 extremidades cromossômicas, o primeiro gene encontrado após a junção foi um gene da família RHS, em 8 extremidades foram genes TS, em 3 foram encontrados retroelementos e em uma extremidade observamos RNA helicase, GP63, e uma proteína hipotética. Em uma das extremidades cromossômicas analisadas (Tel 48) não foi possível determinar o primeiro gene existente após a junção, pois foram encontradas duas repetições teloméricas nesta extremidade cromossômica, ambas seguidas da junção telomérica.
Figura 6. Distribuição das famílias gênicas presentes nas regiões subteloméricas nas bandas cromossômicas de T. cruzi. A. Cariótipo
molecular do clone CL Brener (gel de agarose 1,1% corado com brometo de etídeo). O tamanho das bandas cromossômicas em Mb está indicado a esquerda. De acordo com a nomenclatura proposta por Cano et al., 2005, as bandas cromossômicas foram designadas por algarismos romanos, sendo designada banda I a de menor tamanho. B. Hibridização de sondas derivadas de genes comuns nas regiões subteloméricas com as bandas cromossômicas de T. cruzi. RHSμ “retrotransposon hot spot”; DGF-1μ “dispersed gene family-1”.
VIII - XIX - XX - XVIII - XVI - XV - XIII - IX - XVII - V - III - I - II - IV - VII - VI - X - XIV - XI - XII - - 1.60 - 0.97 - 0.85 - 1.02 - 2.95 - 3.27 - 2.50 - 2.09 - 1.65 - 1.43 - 1.08 - 2.34 - 0.77 - 0.66 - 0.51 - 0.58 - 0.72 - 1.20 - 1.27 - 1.35 CL Brener Mb
A
XIX -XX - XVIII - XVI - XV - XIII - X - VIII - VI - XVII - V - III - I - RHS DGF XIX -XX - XVIII - XVI - XV - XIII - X - VIII - VI - XVII - V - III - II - XII - XIV - XI - IX - VII - IV - XIX -XX - XVIII - XVI - XV - XIII - VIII - VI - V - III - I - IX - N-acetiltransferase XIX -XX - XVIII - XVI - XV - XIV - IX - VIII - VI - XVII - V - III - IV - VII - RNA helicaseB
Grupo I – Tel 4 (TcChr 19S)
Grupo II – Tel 10 (TcChr 26P)
Grupo III – Tel 16 (TcChr 17S)
Grupo IV – Tel 22 (TcChr 11P)
Grupo V – Tel 32 (Tcruzi_7430)
Grupo VII – Tel 37 (TcChr 31P)
Grupo VIII – Tel 39 (TcChr 13P) Grupo VI – Tel 34 (TcChr 13S)
Figura 7. Extremidades cromossômicas de T. cruzi. Mapa esquemático de
extremidades cromossômicas de T. cruzi. As extremidades cromossômicas foram separadas em 13 grupos distintos de acordo com o conteúdo gênico da região subtelomérica. As caixas coloridas representam os genes anotados. As setas azuis indicam o sentido da transcrição. Um representante de cada grupo está sendo mostrado na figura.
Grupo IX – Tel 41 (TcChr 20S)
Grupo X – Tel 43 (Tcruzi_6797)
Grupo XIII – Tel 47 (TcChr 21S): telômeros não classificados Grupo XI – Tel 44 (TcChr 40S)
Grupo XII – Tel 45 (TcChr 15P)
Repetição telomérica
RH“ retrotransposon hot -spot proteins Trans-sialidases
DGF-1 dispersed gene family - 1)
Retroelementos
Proteínas hipotéticas e outros RNA helicase / N-acetiltransferase
A distância média entre a junção telomérica e o primeiro gene foi de 918 pb, porém, é interessante observar que esta distância varia bastante dependendo do gene. Observando a tabela 1 é possível notar que quando o primeiro gene é da família RHS sua distância até a junção é de aproximadamente 700 pb, e no caso de TS encontrada como primeiro gene, a distância é maior, sempre próxima de 1600 pb. Retroelementos SIRE e VIPER podem se localizar mais próximos dos telômeros, em distâncias de aproximadamente 400 pb. Apesar da presença marcante nas proximidades dos telômeros, genes da família DGF-1 não aparecem como primeiro gene após a junção telomérica em nenhuma das extremidades cromossômicas analisadas.
Com o auxílio do programa DNAman foi possível elaborar o mapa de cada uma das extremidades cromossômicas. Alguns mapas estão apresentados na figura 7, e estão indicados os genes em sua posição exata no “contig” e a orientação da transcrição gênica. A orientação das extremidades cromossômicas corresponde àquela indicada nos “contigs” cromossômicos depositados nos bancos de dados TriTryp. De acordo com esta convenção, na figura 4 as extremidades inicial e terminal do cromossomo obedecem ao sentido 5’-3’, conforme indicado na figura. Segundo esta convenção, a extremidade Tel 4 corresponde a extremidade terminal do cromossomo, enquanto a extremidade Tel 32 estaria localizada na extremidade inicial do cromossomo. O sentido da transcrição das sequências subteloméricas é sempre em direção às repetições teloméricas, e, em algumas análises, podemos observar a mudança de fase no início da região intersticial, isto é, os genes sendo transcritos em direção ao centro do cromossomo. Na figura também indicamos as sequências anotadas como (pseudo)genes, por contarem ORFs truncadas ou incompletas.
Comparando as regiões subteloméricas classificamos as extremidades cromossômicas em 13 grupos de acordo com o conteúdo gênico (Tabela 3, Fig. 7). O grupo I contém oito “contigs” (Tels 1 a 8) que possuem os genes RHS, DGF-1, TS, retroelementos, RNA-helicase e/ou N-acetiltransferase em suas regiões subteloméricas. No grupo II foram agrupadas as extremidades contendo genes de TS, DGF-1, RHS e retroelementos (Tel 9 a 15). O grupo III compreende extremidades cromossômicas em que foram anotados genes de
Tabela 3. Agrupamento das extremidades cromossômicas pela sua composição gênica
grupo genes presente na região subtelomérica extremidades
cromossômicas grupo I DGF-1, TS, RHS, Retroelementos, RNA helicase/N-acetiltransferase Tel 1 a 8
grupo II DGF-1, TS, RHS, Retroelementos Tel 9 a 15
grupo III DGF-1, TS, RHS Tel 16 a 21
grupo IV TS, RHS, Retroelementos Tel 22 a 26
grupo V RHS Tel 27 a 32
grupo VI TS e RHS Tel 33 a 36
grupo VII DGF-1, TS, RHS, RNA helicase/N-acetiltransferase Tel 37 e 38 grupo VIII TS, RHS, Retroelementos, RNA helicase/N-acetiltransferase Tel 39 e 40
grupo IX TS Tel 41 e 42
grupo X DGF-1, RHS, Retrotransposons, RNA helicase/N acetiltransferase Tel 43
grupo XI RHS, Retrotransposons, DGF-1 Tel 44
grupo XII RHS, RNA helicase/N-acetiltransferase Tel 45
TS, RHS e DGF-1 (Tels 16 a 21), enquanto o grupo IV compreende aquelas com genes TS, RHS e DGF-1 (Tels 22 a 26). Extremidades cromossômicas que apresentam apenas genes da família RHS em sua região subtelomérica (Tels 27 a 32) estão agrupadas no grupo V, porém este grupo contém “contigs” pequenos, menores que 50 Kb, que provavelmente não representam a região subtelomérica completa. O grupo VI agrupa as extremidades que contém genes das famílias RHS e TS (Tels 33 a 36), o grupo VII as que contém DGF-1, TS, RHS, N-acetiltransferase e/ou RNA-helicase (Tels 37 e 38) e o grupo VIII as com genes RHS, TS, retroelementos, RNA-helicase e/ou N-acetiltransferase (Tels 38 e 39). No grupo IX estão os “contigs” que contém apenas TS (Tels 41 e 42), e ao contrário do grupo V, onde observamos “contigs” menores que 50 Kb, o “contig” 41 é maior que 50 Kb, e provavelmente representa toda a região subtelomérica em questão. Apenas uma extremidade cromossômica (Tel 43) contém somente os genes DGF-1, RHS, retrotransposons, RNA-helicase e N- acetiltransferase. Este “contig” foi classificado separadamente, como grupo X. O grupo XI também contém apenas uma extremidade cromossômica (Tel 44) que contém os genes das famílias RHS e DGF-1 e retroelementos. Finalmente, a extremidade cromossômica Tel 45 contém genes de N-acetiltransferase, RNA-helicase e RHS forma o grupo XII.
Em quatro extremidades cromossômicas (Tels 46 a 49), a repetição telomérica está localizada internamente no “contig”. Estas quatro extremidades foram agrupadas no grupo XIII (Fig. 7). Duas hipóteses poderiam explicar a presença das repetições teloméricas no interior dos “contigs”μ 1) ocorreu um erro durante o alinhamento das sequências in silico, que resultou na integração das duas extremidades cromossômicas diferentes em um mesmo contig; ou 2) ocorreu a fusão de diferentes telômeros no parasita, formando cromossomos que contém a repetição telomérica em seu interior.
A partir dos mapas elaborados das regiões subteloméricas, foi possível observar a organização gênica destas regiões. Genes RHS e TS podem ser encontrados isolados, como nas extremidades cromossômicas Tel 32 (RHS) e Tel 41 (TS), porém, é mais comum observá-los organizados em diversas cópias, próximas umas das outras. A organização mais comum (extremidades
Tel 1, 2, 3, 9, 11, 12, 17, 22, 23, 34, 36 e 39), é a presença de um ou mais genes de TS flanqueado, nas duas extremidades, por genes RHS.
Kim e colaboradores relataram a presença de cópias de genes DGF-1 flanqueadas por TS e/ou RHS (Kim, Chiurillo et al., 2005). Está organização parece estar correta, pois nenhuma região subtelomérica analisada contém genes DGF-1 isolados, estando todos adjacentes a uma das duas famílias citadas acima. Outra curiosidade sobre os genes da família DGF-1 é que eles podem estar presentes em cópia única na extremidade cromossômica (Tel 8) , mas na maioria das vezes se organizam em tandem, com diversas cópias em sequência, flanqueadas, dos dois lados, principalmente por genes de proteínas RHS.
A organização de genes RHS flanqueando genes de proteínas de superfície (TS e/ou DGF-1) pode ser um indício de que estes sítios tiveram papel importante na geração de variantes de proteínas de superfície pelo parasita. As sequências repetitivas presentes nos genes e (pseudo)genes RHS poderiam ser utilizadas como alvo por mecanismos de recombinação homologia (HR) e/ou por microhomologia (MMEJ), permitindo a geração de variantes pela recombinação de diferentes extremidades cromossômicas.
Muitas das cópias (53 cópias) DGF-1 representam genes íntegros, sendo algumas delas com tamanho superior a 10 Kb. Estes genes poderiam ser expressos pelo parasita, o que indica que as regiões teloméricas não são apenas um sítio de geração e armazenamento de variantes de antígenos de superfície, podendo funcionar também como locais de transcrição ativa destes genes.
A caracterização das regiões subteloméricas reforça os dados de trabalhos anteriores (Chiurillo, Cano et al., 1999; Kim, Chiurillo et al., 2005), que já haviam relatado a presença de genes das famílias RHS, DGF-1 e TS na região subtelomérica de T. cruzi. A análise mapeia pela primeira vez diversas regiões subteloméricas, fornecendo importantes dados sobre a organização destas regiões.
4.1.3 Identificação e caracterização in silico dos genes de trans-sialidases