Este estudo descreve as importantes diferenças observadas nas propriedades farmacológicas de receptores B1 e B2 de cininas, da AII e da ET-1, resultante da
investigação sobre a reatividade de fundus do estômago e da aorta abdominal, isolados de camundongos nocaute B1 ou B2 ou duplo nocaute B1 e B2 de cininas.
Estudo anterior (Barbosa, 2002) demonstrou que no estômago de camundongo, onde os receptores B1 e B2 são constitutivamente expressos, a ausência da resposta
contrátil à DBK no animal KOB1 não afetou a afinidade aparente da BK e não promoveu
superexpressão do receptor B2 mas reduziu drasticamente a eficácia das respostas à BK.
Além disso, resposta reduzida ao nitroprussiato de sódio, agente relaxante, foi detectada. No presente trabalho, foi verificado que a resposta máxima reduzida à BK no nocaute B1 não era devida a contribuição de produtos da ciclo-oxigenase ou da via do óxido nitrico,
ou da ativação do canal de K+, desde que o efeito da indometacina (10-6 M), do N-nitro-L arginina metil ester (L-NAME, 10-3M), e da apamina, não reverteram a inibição da resposta máxima à BK, descartando-se o envolvimento desses mediadores, que estimulariam o relaxamento, levando à redução da contração. Já foi observado que o receptor B2 da BK
pode interagir diretamente com o receptor AT1, formando heterodímeros estáveis,
causando redução na ativação do receptor B2 e aumento na do receptor AT1 (AbdAlla et
al., 2.000). Sugere-se que essa dimerização foi aumentada pela ausência do receptor B1,
sendo responsável pela menor eficácia da BK no estômago isolado de animais nocaute B1. Não há relatos na literatura sobre taquifilaxia à BK em fundus de estômago de
camundongo, mas Barbosa (2002) demonstrou a ocorrência de taquifilaxia nesse tecido em estudo, que se mostrou acentuada em animais transgênicos KOB1. Este dado reforça
a idéia de que nesta preparação a presença do receptor B1 é necessária para regular um
mecanismo que atenua o desenvolvimento de resposta taquifilática induzida pelo receptor B2. É possível que na ausência do receptor B1 ocorra mecanismo de dimerização entre os
receptores B2 (AbdAlla et al., 1999) um processo que leva à rápida dessensibilização ou
taquifilaxia de uma série de receptores (Angers, 2.001).
Estudando animais nocaute B2, foi verificado que a reatividade a resposta à DBK
estava inalterada quanto à potência e eficácia. Esses resultados indicaram que a ausência do receptor B2 eliminou a resposta à BK, sem influenciar o sistema do receptor B1, o que
foi confirmado pela verificação por meio de determinações de RNA mensageiro para o receptor B1 cujo nível permaneceu inalterado no animal nocaute. Essas observações
confirmam os dados referidos por Nsa Allogho et al. (1998). No entanto, é interessante ressaltar que para o caso dos receptores AT1 e AT2 da AII, quando o gene para o receptor
AT2 foi rompido, o receptor AT1 foi superispresso e as respostas à AII foram potenciadas
no músculo vascular (Tanaka et al., 1999).
As respostas à ET-1 indicaram que nos animais nocaute B1 e B2 a potência do
agonista foi mantida no fundus do estômago. Da mesma forma a taquifilaxia induzida nessa preparação foi semelhante nos 3 tipos de animais. A determinação do conteúdo de ET-1 presente no estômago isolado mostrou que havia marcante aumento no estômago de animal KOB1. Esse aumentado nível de ET-1 endógena pode ter relação com a
redução do efeito máximo da BK no KOB1, reforçando a observação feita anteriormente
por Tanus-Santos et al. (2000) que a ET-1 diminui efeito induzido pela BK. Dados na literatura relatam que a ET-1 está presente no trato gastrointestinal de ratos, produzida pelas células endoteliais vasculares e pelas células epiteliais da mucosa gástrica, a qual pode causar contração do músculo liso gastrointestinal, sugerindo que a ET-1 pode ter um papel fisiológico no controle da função gastrointestinal (Takahashi et al., 1990). É possível que a concentração aumentada de ET-1 por nós observada tenha relação com os níveis de NO e cGMP aumentados no KOB1, desde que uma relação entre ET-1 e NO já foi
previamente observada (Rossi et al., 2001).
A observação que o efeito da AII no estômago de camundongos nocaute B1 e B2
em comparação com o WT, não diferiu na afinidade nem na eficácia, sugeriu não haver qualquer interação direta do receptor B2 das cininas com a ativação in vitro do sistema
renina-angiotensina. Entretanto a taquifilaxia à AII nos nocautes B1 e B2 foi atenuada
contrariando esta hipótese. Já está demonstrado que ocorre heterodimerização entre receptores B1 e B2 que aumenta a sinalização (Kang et al., 2004). É assim possível que na
ausência do receptor B1 tenha ocorrido dimerização preferencial entre os receptores B2
(AbdAlla et al., 1999) em detrimento da heterodimerização entre os receptores AT1 e B2
que foi demonstrada diminuir o efeito da BK e aumentar o da AII (AbdAlla et al., 2000) o que explicaria a taquifilaxia atenuada para a AII no KOB1.
Com relação ao efeito relaxante à BK e DBK no estômago de camundongos, é importante ressaltar que esta é a primeira referência à falta de relaxamento do estômago
de camundongo em resposta aos peptídios, pois esse tecido em outras espécies apresenta resposta relaxante às cininas (Downing e Morris, 1981; Calixto e Medeiros, 1992). Foi interessante verificar que a inibição do efeito relaxante induzido pelo SNP, no estômago de KOB1, não mais foi observado no KOB2. A observação que houve
potenciação da resposta relaxante pelo zaprinast, inibidor da fosfodiesterase, no estômago isolado de animais WT e transgênicos KOB2 enquanto em animais KOB1 houve
manutenção na inibição das respostas, reforçou a hipótese que o reduzido relaxamento seria devido à diminuição prévia do tônus muscular, razão pela qual houve atenuação no efeito induzido pelo NPS. Já foi demonstrado em estudo anterior que o efeito relaxante de NPS no fundus gástrico é mediado por cGMP que ativa Ca2+-ATPase, sensível a ryanodina (Cohen et al., 1999). É portanto, sugerido que o acúmulo de cGMP pelo elevado teor de NO no estômago de animais KOB1 já comentado (Barbosa, 2002) foi responsável
pela inibida resposta ao NPS. Reforçando essa idéia, atenuação do relaxamento a doadores de NO foi também observada por outros grupos, em diferentes modelos experimentais em que a atividade da NO sintase se apresentava aumentada (Ohashi et al.1998; Yamashita et al., 2000).
Na segunda parte deste estudo, músculo vascular aortico de animais KOB1 e KOB2
foi usado para a avaliação das respostas contráteis induzidas pela BK para obter dados sobre a sensibilidade desse peptídio bem como de outros peptídios relacionados, AII e ET-1 em comparação com músculo não vascular.
A BK induziu respostas na aorta abdominal e na aorta torácica, embora esta ultima fosse muito pouco sensível. Não há relatos sobre a farmacologia da BK na aorta isolada de camundongos, mas essa maior sensibilidade da aorta abdominal foi também observada para o caso da AII (Zhou et al., 2003) e para ET-1 (Zhou et al., 2004). A sensibilidade da BK nesta preparação mostrou ser menor que a da ET-1 e da AII. No KOB1, houve uma
redução drástica na resposta máxima à BK, como foi observado para o caso do fundus de estômago. A verificação que a DBK não induziu respostas na aorta até 4 h de observação sugeriu que a densidade de receptores B1 seria muito baixa ou não haveria expressão
constitutiva desse receptor neste tecido vascular, diferentemente do observado no estômago. Entretanto a drástica redução na eficácia da BK em induzir resposta na ausência do receptor B1 sugeriu a presença desse receptor exercendo seu papel funcional
atividade mecânica em resposta a DBK. Na aorta de rato foi também detectada uma população muito baixa de receptores B1 de cininas (Schaeffer et al., 2001). É possível que
a redução nas respostas à BK no KOB1 tenha decorrido da falta de dimerização do
receptor B2 com o receptor B1.
Quanto às respostas à ET-1, o efeito máximo diminuído no KOB1, sugeriu alguma
interação negativa entre o receptor B2 e da ET-1, causando atenuação do efeito. Se esta
hipótese for correta a dimerização entre os receptores B1 e B2 (Kang et al., 2004) evita a
interação entre os sistemas cininas e endotelina. A observação que na aorta de animais com duplo nocaute, o efeito induzido pela ET-1 foi revertido, reforça esta hipótese. Interessante observar que a dosagem de ET-1 na aorta não revelou qualquer diferença entre os dados obtidos em WT, KOB1 e KOB2. Possivelmente nesta preparação o teor de
ET-1 endógeno não tem correlação com os receptores de cininas e a reatividade do agonista exógeno, diferentemente do sujerido para o caso de estômago de KOB1. As
respostas à ET-1 não foram afetadas pelo L-NAME, o que leva a concluir que não há mediação pelo NO. Esse dado está em contraste com o relatado por Zhou et al. (2004), que sugeriram envolvimento de relaxamento-dependente de NOs na resposta contrátil à ET-1.
Com relação aos efeitos induzidos pela AII, a observação que em aortas de nocautes B1 e B2 o efeito máximo foi reduzido mas o tratamento com PD123319, antagonista do
receptor AT2 e considerado inibidor funcional do receptor AT1 (AbdAlla et al., 2000), não
potenciou o efeito máximo indicando que não havia contribuição do receptor AT2 que
ativado, diminuiria o efeito da AII. Esse resultado está de acordo com Zhou et al. (2003) que também não observaram envolvimento do receptor AT2 na ação da AII mediada pelo
receptor AT1. L-NAME não afetou as respostas à AII, indicando que não há envolvimento
do NO na contração máxima reduzida nos nocautes. Em conformidade com os nossos dados, Zhou et al., (2003) também relataram que o efeito da AII na aorta abdominal não é mediado pelo NO.
A aorta de camundongo se mostrou bastante taquifilática a BK, à AII e à ET-1 que provavelmente resultou das respostas lentas e de longa duração além do período prolongado para a recuperação das preparações após cada estímulo com os agonistas.
Os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que tanto no fundus do estômago como na aorta, há expressão funcional dos receptores B1 e B2 que exercem
papéis importantes, com interferência nas vias de sinalização através de interações ora com receptores de cininas ora com receptores de outros agonistas.