Clonagem de um fragmento de 1,7 Kb amplificado por PCR do clone telomérico BacD6
No item anterior (4.1) nós mostramos que existe uma grande variabilidade entre as extremidades cromossômicas de T. cruzi. Apesar disso, o conteúdo gênico da região subtelomérica é relativamente conservado no que diz respeito ao número de famílias gênicas encontradas nesta região: TS, RHS, DGF-1, RNA-helicase e N-acetiltransferase. Desta maneira, a variabilidade encontrada na região subtelomérica é conferida pelo número de variantes identificadas na região. Por exemplo, encontramos 127 variantes da família TS (Tc85, GP85, GP82, GP90, etc...). Um dos objetivos desta tese é investigar a possível participação das regiões subteloméricas na geração de variantes da família TS. A estratégia utilizada foi subclonar segmentos da região subtelomérica em um vetor capaz de atuar como um cromossomo artificial de T. cruzi (pTAC), desenvolvido por Lorenzi e colaboradores (Curto et al., submetido).
As regiões subteloméricas de T. cruzi foram clonadas no vetor pBelo BAC e caracterizadas por Kim e colaboradores (Kim, Chiurillo et al., 2005). Um dos clones obtidos, denominado BacD6 (GenBank AY551440; inserto 29.428 pb) foi utilizado nos experimentos descritos a seguir. A figura 10 apresenta um esquema com os genes e sequências repetitivas presentes no clone BacD6.
Figura 10: Clone telomérico BacD6. A: Representação esquemática do
BacD6 B: ORFs preditas pelo programa ORF Finder no clone BacD6. Indicada pela seta vermelha está a ORF de 273 nucleotídeos que codifica a região N- terminal da proteína GP85, contida no (pseudo)gene GP85 do BacD6. C: sequência de nucleotídeos e aminoácidos da ORF destacada em B.
0 Kb 5 10 15 20 25 gp85φ dgf-1 rhsφ gp85φ rhsφ tel Bac D6 (29.248 pb) região duplicada A B 0 Kb 5 10 15 20 25 +1 +2 +3 C
Analisando a sequência do BacD6 com o programa “ORF finder” do NCBI identificamos uma ORF (“open reading frame” – fase aberta de leitura) que codifica a região N-terminal da GP85. O início desta ORF é no nucleotídeo 21.207 e ela codifica 91 aminoácidos (nucleotídeos 21.480-21.482) até ser interrompida por um códon de terminação.
Resolvemos fazer uma construção contendo esta ORF e parte da região duplicada que flanqueia o pseudogene na região 5’ (Fig.10). Para isso foram desenhados dois oligonucleotídeos para amplificar uma região de 1.670 pb contendo a ORF gp85 e a repetição Seq3Tc (Fig. 10A e 11A). Um primeiro oligonucleotídeo (Kpnφgp85-Fwd) alinha nos nucleotídeos 19.809 a 19.821 e contém um sítio para a enzima KpnI na região 5’, para facilitar sua posterior clonagem no vetor comercial pGEM-3Z (Promega). O outro oligonucleotídeo (Bamgp85-Rev) utilizado alinha a partir do último códon da ORF (nucleotídeos 21479-21466) e em sua região 5’ foi inserido um sítio para a enzima BamHI. A amplificação por PCR utilizando como molde o DNA do BacD6 com os oligonucleotídeos descritos resultou em um fragmento de 1,7 Kb como esperado (Fig. 11A-B). O produto de PCR foi purificado do gel com o “kit” Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System e clonado em plasmídeo pGEM-T. As colônias brancas (recombinantes) foram selecionadas e cultivadas em meio LB líquido, sendo feita em seguida a extração do DNA por lise alcalina. O DNA foi então digerido com as enzimas KpnI e BamHI para liberação do inserto de 1,7 Kb conforme esperado (Fig. 11C). O sequenciamento confirmou a presença da ORF da região N-Terminal do (pseudo)gene gp85 nos clones. Nos experimentos subsequentes foi utilizado o DNA de um dos clones, denominado pGEM-gp85-1.
Fusão do fragmento gp85 de 1,7 Kb com o gene da GFP (“green fluorescent protein”)
Antes do fragmento gp85 ser subclonado no vetor pTAC para posterior transfecção em epimastigotas de T. cruzi, havia a necessidade de inserção de um gene repórter. Escolhemos o gene da GFP (“green fluorescent protein”) porque a utilização de proteínas em fusão com GFP em T. cruzi e outros parasitas tem sido relatada por outros grupos com resultados positivos
(Weston, La Flamme et al., 1999; Guevara, Dias et al., 2005). Trata-se de uma excelente marca para detecção do gene por hibridização de DNA e da expressão do gene por microscopia de fluorescência.
O plasmídeo pEGFP-N1 (Fig. 12A) contém o gene GFP modificado, chamado EGFP, inserido adjacente ao sítio múltiplo de clonagem, permitindo a fusão do inserto à região N terminal da GFP. No sítio múltiplo de clonagem existem sítios para as enzimas KpnI e BamHI (Fig. 12A), que foram escolhidos para a clonagem do fragmento amplificado por PCR.
Após digestão do DNA do clone pGEM-gp85-1 com KpnI e BamHI (Fig. 11C) e purificação do inserto, este foi clonado no plasmídeo pEGFP-N1 digerido com as mesmas enzimas. As colônias recombinantes foram selecionadas após hibridização de membranas contendo o DNA das colônias com sonda radioativa do (pseudo)gene gp85. A presença do inserto nos clones selecionado foi confirmada por análise de restrição (Fig. 12B) e sequenciamento. Os clones pEGFP-gp85-1 contém a sequência gp85 em fusão com o gene da GFP, gerando um fragmento de 2,43 Kb denominado gp85-GFP-1.
Clonagem do fragmento gp85-GFP-1 no vetor pTAC
O vetor pTAC (Fig. 13A) possui o sítio de clonagem KpnI e comporta insertos de mais de 10 Kb (Lorenzi, 2001). Para a inserção de um sítio KpnI na região 3’ do fragmento gp85-GFP-1 foi feito uma PCR, utilizando os oligonucleotídeos Kpngp85-Fwd e KpnEGFP-Rev, que alinha no final do gene da GFP e contém um sítio KpnI externo. O produto de 2,4 Kb (Fig. 12C), correspondente ao fragmento gp85-GFP-1, contendo sítios KpnI em ambas as extremidades, foi clonado no plasmídeo pGEM-T e analisado por digestão com enzimas de restrição e sequenciamento.
Os clones pGEM-T-gp85-GFP-1 foram digeridos com a enzima KpnI que libera o inserto e permite sua subclonagem no vetor pTAC, previamente digerido com KpnI. A presença do inserto no clone foi determinada por digestão (Fig. 13C) e sequenciamento e a construção denominada pTAC-gp85-1 (Fig. 13B).
Figura 11: Amplificação e clonagem de um fragmento de 1,7 Kb do BacD6. A: Diagrama esquemático do BacD6, o retângulo laranja representa a região
amplificada. B: Eletroforese em gel da garose (0,8%) dos produtos de PCR utilizando como DNA molde o BacD6 (D6) e água (H2O). C: DNA plasmidial do clone pGEM-gp85-1 (4,7 Kb) e digestão com KpnI e BamHI, liberando inserto de 1,7 Kb. Como padrão de tamanho molecular (PM) foi utilizado o DNA do fago lambda digerido com HindIII.
gp85φ dgf-1 rhsφ gp85φ rhsφ tel Bac D6 (29.248 pb) região duplicada Amplicon (1,7 Kb) A 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 4,3 - 2,3 - PM Kb D6 H2O 1,7 - B 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 4,3 - 2,3 - 1,7 - Kb PM gp85-1 gp85-1 pGEM- pGEM- KpnI/BamHI C
Figura 12: Clonagem do amplicon GP85-1 no plasmídeo pEGFP-N1. A.
Plasmídeo pEGFP-N1. O sítio múltiplo de clonagem e o gene da “green fluorescent protein” (EGFP) estão indicados na figura. B. Digestão do clone pEGFP-gp85-1 com as enzimas KpnI e BamHI e liberação do inserto de 1,7 Kb, correspondente ao fragmento gp85. C. Amplificação por PCR do fragmento gp85-GFP (2,4 Kb) utilizando como molde o DNA do clone pEGFP-gp85-1. PM: padrão de tamanho molecular, DNA do fago lambda digerido com a enzima HindIII.
A
Sítio múltiplo de clonagem:
2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 4,3 - 2,3 - 1,7 - Kb PM gp85-1 pEGFP KpnI/BamHI B 2,0 - 9,4 - 6,5 - 4,3 - 2,3 - 23,1 - Kb PM gp85-1 pEGFP C
Figura 13: Clonagem do fragmento gp85-GFP no vetor pTAC. A.
Representação esquemática do vetor pTAC: região espaçadora (branco); região telomérica (cinza); HX1, região intergênica do gene TcP2 (verde); espaçador intergênico do gene GAPDH (amarelo); genes de resistência a ampicilina (rosa), puromicina (marron) e gene neomicina (azul). O sentido de transcrição dos genes está indicado na figuras por ► ou ◄. Os sítios das enzimas de restrição estão indicados. A seta vermelha indica o sítio de clonagem (KpnI). B. Plasmídeo pTAC-gp85-1, com o sítio de inserção do fragmento gp85-GFP destacado com as setas vermelhas. C. Eletroforese em gel de agarose (0,8%) do DNA do plasmídeo pTAC-gp85-1 digerido com a enzima KpnI. A banda de 2,3 Kb liberada corresponde ao inserto gp85-GFP. PM: padrão de tamanho molecular (DNA do fago lambda digerido com a enzima HindIII).
0 Kb 2 4 6 8 10 12
H
X
1
Espaçador Tel GAPDH Neo GAPDH Amp Pac GAPDH Tel
Hind III EcoRI HindIII SphI KpnI Sac I EagI
0 Kb 2 4 6 8 10 12
H
X
1
Espaçador Tel GAPDH Neo GAPDH Amp Pac GAPDH Tel
0 Kb 2 4 6 8 10 12
H
X
1
Espaçador Tel GAPDH Neo GAPDH Amp Pac GAPDH Tel
Hind III A
Hind III Hind III KpnI Kpn I
0 Kb 2 4 6 8 10 12 14
H
X
1
Espaçador Tel GAPDH Neo GAPDH GFP GP85 Amp Pac GAPDH Tel
B C 4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - pTAC KpnI Kb PM gp85-1
Clonagem de um fragmento de 6,5 Kb do BacD6
Diversos trabalhos relatam a capacidade de recombinação e reparo de DNA em T. cruzi provavelmente por recombinação homóloga (HR), uma vez que a maquinaria de recombinação não homóloga (NHEJ) não foi encontrada no parasita até o momento (El-Sayed, Myler et al., 2005; Ivens, Peacock et al., 2005; Passos-Silva, Rajao et al., 2010). Sendo assim, a presença de regiões repetitivas, que podem ser utilizadas durante o alinhamento de regiões homólogas para eventos de recombinação pode ser essencial para esses eventos. Para verificar se o tamanho da região repetitiva adjacente ao (pseudo)gene GP85 influenciaria a recombinação, foi feita uma segunda construção, contendo um maior fragmento do BacD6.
Observando o mapa de restrição do BacD6 verificamos que uma região de 6,5 Kb contendo o (pseudo)gene GP85 e regiões adjacentes poderia ser liberada pela digestão com as enzimas XbaI e SalI (Fig. 14A). O sítio XbaI está localizado na posição nucleotídeo 18.853 e o sítio SalI na posição 25.164 do BacD6. No vetor de clonagem pGEM-3Z existem sítios para estas enzimas (Fig. 14B), que foram utilizados para a subclonagem do fragmento. Esta construção foi denominada pGEM-3Z-gp85-2 e os clones obtidos foram analisados por digestão com enzimas de restrição (Fig. 14C) e sequenciamento.
Na região central do (pseudo)gene GP85 encontramos uma ORF de TS truncada, onde existe um sítio para a enzima ApaI (posição 21.758 – Fig. 14A). Por se tratar de um sítio único no fragmento esta região foi escolhida para a inserção de um gene repórter GFP. Para isso foram desenhados dois oligonucleotídeos para amplificar o gene GFP do plasmídeo comercial pEGFP- N1. Na extremidade dos oligonucleotídeos foi adicionado o sítio de restrição da enzima ApaI (oligonucleotídeos ApaEGFP-Fwd e ApaEGFP-Rev). O gene GFP foi então amplificado por PCR utilizando como molde o DNA do vetor comercial pEGFP-N1, gerando um produto de 700 pb (Fig. 15A), que foi clonado no vetor pGEM-T. A integridade do inserto GFP foi confirmada por digestão com enzimas de restrição e sequenciamento.
Figura 14. Clonagem de um fragmento telomérico de 6,5 Kb, derivado do BacD6. A. Representação esquemática do BAC D6 com os sítios de restrição
utilizados na construção do pTAC-gp85-2. B. Mapa do vetor pGEM-3Z. C. Digestão do plasmídeo pGEM-3Z-gp85-2 com as enzimas XbaI e SalI para a liberação do inserto de 6,5Kb do vetor pGEM-3Z (banda de 2,7 Kb). PM: padrão de tamanho molecular (DNA do fago lambda digerido com a enzima HindIII).
Xba I ApaI Sal I
gp85φ dgf-1 rhsφ gp85φ rhsφ tel Bac D6 (29.248 pb) região duplicada A B 4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - pGEM-3Z XbaI/SalI Kb PM gp85-2 C
Figura 15. Clonagem do fragmento telomérico gp85-2-GFP no plasmídeo pEGFP-N1. A. Amplificação por PCR do gene EGFP, do plasmídeo pEGFP-
N1, utilizando “primers” contendo o sítio ApaI. B. Digestão do clone pGEM-3Z- gp85-2-GFP com a enzima ApaI para confirmar a presença do inserto de 0,7 Kb. Como controle foi digerido o DNA do clone pGEM-3Z-gp85-2. C. Liberação do inserto gp85-2-GFP (7,2 Kb) do plasmídeo pGEM-3Z (2,3 Kb) pela digestão com as enzimas EcoRI e SalI. D. Representação esquemática da construção pEGFP-N1-gp85-2-GFP, com indicação dos sítios de restrição utilizados. E. Digestão do plasmídeo pEGFP-N1-gp85-2-GFP com a enzima KpnI, com a liberação do inserto de 7,2 Kb. Como controle (ctrl) foi utilizado o vetor pEGFP-N1, de 4 Kb. PM: padrão de tamanho molecular (DNA do fago lambda digerido com a enzima HindIII).
4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - Kb PM pEGFP-N1 A 0,7 - 0,5 - 4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - Kb PM GFP ctrl B 0,7 - 0,5 - pGEM-3Z -gp85-2 ApaI 4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - Kb PM gp85-2-GFP C pGEM-3Z EcoRI - SalI D
EcoRIKpn I Xba I Sal I Kpn I
pEGFP-N1-gp85 -2-GFP GFP gp85 gp85 Kana E 4,3 - 2,0 - 23,1 - 9,4 - 6,5 - 2,3 - Kb PM ctrl gp85-2-GFP pEGFP-N1 KpnI
O inserto GFP foi liberado do vetor pGEM-T pela digestão com a enzima Apa I e, posteriormente, subclonado no plasmídeo pGEM-3Z-gp85-2, previamente digerido com a mesma enzima. A clonagem do inserto e sua correta inserção na fase aberta de leitura foram confirmadas por PCR, digestão (Fig. 15B) e sequenciamento. Esta construção foi chamada pGEM-3Z-gp85-2-GFP.
O sítio para a enzima KpnI é ideal para clonagem no vetor pTAC (Fig. 13A). Todavia a construção pGEM-3Z-gp85-2-GFP possui o sítio KpnI em apenas uma extremidade do inserto (proveniente do sítio existente no vetor pGEM-3Z). Para clonar o fragmento seriam necessários sítios KpnI nas duas extremidades do inserto. Para solucionar este problema decidimos clonar o inserto liberado pelas enzimas EcoRI e SalI (Fig. 15C) no vetor pEGFP-N1 (Fig. 12). Este vetor, além dos sítios EcoRI e SalI também possui o sítio KpnI. Com esta clonagem conseguimos uma construção contendo um inserto com sítios KpnI nas duas extremidades (Fig. 15D). Esta construção foi denominada pEGFP-N1-gp85-2, e a integridade do inserto foi confirmada por digestão (Fig. 15E) e sequenciamento.
O inserto liberado da construção pEGFP-N1-gp85-2 com a enzima KpnI foi purificado e ligado ao vetor pTAC previamente digerido com a mesma enzima. Foram obtidos dois clones contendo o inserto esperado, chamados pTAC- gp85-2.5 e 2.6, com tamanho de 19,5 Kb (Fig 16A). A presença do inserto nos clones foi confirmada por análise de restrição (Fig 16B) e sequenciamento.