Mecanismos de reparo de DSBs são alguns dos responsáveis pela plasticidade genômica em diversos organismos e podem ter papel importante na variação e variabilidade antigênicas em tripanossomatídeos.
Em eucariotos, o processo de NHEJ envolve diversas proteínas e inicia-se com o reconhecimento das DSBs pelo complexo protéico formado pelas proteínas Ku70 e Ku80. Este processo pode religar moléculas de DNA diferentes. Para isso, as extremidades de DNA devem ser modificadas antes da ligação, pela remoção de nucleotídeos pelas DNA-PKs (proteínas quinases dependentes de DNA) (Mcvey e Lee, 2008) ou pela adição de nucleotídeos por polimerases envolvidas no processo (polimerases µ e , família Pol IX) (Ma, Lu et al., 2004). A modificação das extremidades de DNA anterior à ligação pode então causar deleções ou inserções, diminuindo assim a fidelidade do reparo do DNA por esta via. Em mamíferos, o complexo Ku interage com as DNA-PKs e com polimerases (Sandoval e Labhart, 2002; Ma, Lu et al., 2004) permitindo modificações nas extremidades livres de DNA, que serão ligadas pela ação do complexo protéico DNA Ligase IV/XRCC4 (Critchlow, Bowater et al., 1997; Kass e Jasin, 2010).
Em T. brucei, T. cruzi e L. major foram identificadas proteínas Ku70 e Ku80, porém, estudos em T. brucei descrevem o papel destas proteínas na manutenção dos telômeros neste parasita, não sendo notada nenhuma função destas proteínas no reparo de DSBs induzidas artificialmente (Conway, Mcculloch et al., 2002; Burton, Mcbride et al., 2007). Nos tripanossomatídeos, outros genes de proteínas da maquinaria de NHEJ como a DNA Ligase IV e XRCC4 não foram identificados até o momento, o que coloca em dúvida a existência deste mecanismo nos parasitas (Passos-Silva, Rajao et al., 2010). O mecanismo de recombinação homóloga (HR) constitui a principal via de reparo de DSBs em eucariotos inferiores (Bhattacharyya, Norris et al., 2004). A HR se inicia com a formação de regiões simples fita 3’ (“3’ single strand overhangs”) nas extremidades da DSB. Estudos em Saccharomyces cerevisiae sugerem que o complexo MRX, formado por MRE11, RAD50 e XRS2, é necessário para o processamento inicial da extremidade, que envolve também
uma exonuclease específica 5’-3’ (Exo1) ou o complexo DGS1/DNA2, que possui atividades de helicase e nuclease (Sung e Klein, 2006). As extremidades simples fita 3’ se ligam à proteína de replicação A (RPA), que estimula o recrutamento de diversas outras proteínas, como RAD51 e BRCA2 (San Filippo, Sung et al., 2008). A RAD51 é um proteína essencial no processo, uma ATPase dependente de DNA que forma filamentos nucleoprotéicos com a simples fita. Após se ligar ao DNA, RAD51 catalisa a invasão de uma dupla fita homóloga pela extremidade simples fita 3’, formando uma região de fita tripla, chamada “tríplex” (Fig. 4) (Sung e Klein, 2006). Ocorre então a síntese da fita “invasora”, complementar a sequência da fita molde do tríplex.
A fase final da HR, também chamada de resolução, pode ocorrer por dois mecanismos. O primeiro mecanismo é chamado de SDSA (“synthesis- dependent strand annealling”). Neste mecanismo a fita invasora se desprende do tríplex e se alinha com a região homóloga da outra extremidade da DSB e se religa, permitindo o preenchimento da simples fita da extremidade “não invasora” da DSB. Este mecanismo repara a fita original que sofreu DSB sem que ocorram grandes recombinações entre as fitas, os chamados “crossovers”. A segunda via de resolução de HT é usualmente chamada de DSBR (“double strand break repair”) e ocorre após a formação de uma “junção dupla de Holliday”, pela aproximação da outra extremidade da DSB. A junção dupla de Holliday deve ser resolvida com a quebra e religação das fitas de DNA. Durante este processo as fitas podem se religar de maneira idêntica a sua conformação anterior à DSB, ou podem formar moléculas que contém grandes fragmentos de DNA de diferentes moléculas dupla-fita originalmente presentes na reação – os chamados “crossovers” (Fig. 4) (Sung e Klein, 2006).
O mecanismo de HR é capaz de reparar DSBs com maior fidelidade, pela utilização de cromossomos ou sequências homólogas. Entretanto em genomas ricos em sequências repetitivas este processo pode causar a recombinação de grandes fragmentos de DNA, aumentando a plasticidade do genoma. Estudos recentes em S. cerevisiae comprovam que a recombinação homóloga pode causar a reorganização no genoma deste fungo, principalmente durante o reparo de DSBs em regiões de sequências repetitivas (Argueso, Westmoreland et al., 2008).
Figura 4: Reparo de DSBs por recombinação homóloga (HR). Após a
quebra na dupla fita de DNA, as extremidades são modificadas, com a formação de extremidades 3’ livres. As extremidades livres são capazes de invadir regiões dupla-fita de DNA homólogas. Após a invasão, ocorre a extensão de DNA na fita invasora.
A via de resolução DSBR ocorre com a formação da junção dupla de Holliday, após a aproximação da outra extremidade da DSB. A resolução da junção resulta em moléculas de DNA contendo fragmentos das duas dupla-fita originais. Esta via pode resultar nos chamados “crossovers”, moléculas contendo grandes fragmentos de DNA não homólogos, adjacentes às sequências homólogas. A via SDSA sempre resulta na formação de moléculas iguais as originais, pela separação da fita invasora do tríplex e posterior alinhamento com a outra extremidade da DSB. O DNA recém sintetizado está indicado pela linha pontilhada.
Quebra na dupla fita de DNA (DSB)
Edição das extremidades 3’
Invasão da dupla-fita homóloga (formação do tríplex)
Síntese da extremidade 3’
DSBR SDSA
Junção dupla de Holliday Alinhamento das extremidades da fita original
Reparo sem a formação de “crossovers”
Reparo com a formação de “crossovers”
Síntese da fita 3’ não invasora e religação.
Diversas proteínas que participam dos processos de HR foram identificadas em tripanossomatídeos, como MRE11(Robinson, Mcculloch et al., 2002; Tan, Leal
et al., 2002) RAD51, RAD50 (Mcculloch e Barry, 1999), RPA, BRCA2 e RAD54
(Berriman, Ghedin et al., 2005). A caracterização de algumas destas proteínas (MRE11, RAD51 e BRCA2) comprovou seu papel no reparo do DNA de parasitas tratados com agentes indutores de DSBs (radiação ionizante ou drogas como a zeocina) (Mcculloch e Barry, 1999; Robinson, Mcculloch et al., 2002; Hartley e Mcculloch, 2008). A caracterização de RAD51 mostrou que a superexpressão desta proteína pode afetar a frequência de troca de variantes de proteínas de superfície (VSGs) expressas, sendo um indício da participação da HR na variação antigênica (Mcculloch e Barry, 1999).
Em T. cruzi e L. major, foi demonstrado o papel de RAD51 no reparo de DSBs induzidas por radiação ionizante (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006). É interessante ressaltar que estes parasitas são muito resistentes à radiação ionizante, fato que não ocorre em T. brucei (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006; Passos-Silva, Rajao et al., 2010). A expressão de Rad51 nestes parasitas pode ser aumentada em casos de lesão no DNA, fato que não ocorre em T. brucei (Mckean, Keen et al., 2001; Regis-Da-Silva, Freitas et al., 2006; Passos-Silva, Rajao et al., 2010). Este mecanismo pode conferir vantagem durante a invasão de células, onde o estresse oxidativo e a consequente formação de radicais livres, pode causar lesões no DNA. O fato do T. brucei ser um parasita de vida extracelular poderia explicar o não desenvolvimento deste mecanismo neste tripanossomatídeo.
1.5.2. A via de reparo de DNA por micro-homologia e seu papel nos