B. Tipos de calcificación
2. Post-translational modifications and generation of AGEs
2.1. In diabetes: AGEs as molecular signature of hyperglycemia and oxidative stress
Chronic hyperglycemia, but not only, promotes the formation of modified molecular species, with a high heterogeneity of structure, which collectively were called AGEs. As many excellent reviews have described in detail the reaction path-ways of AGE formation and their structure [6], here only the main pathways of AGE formation are described. The forma-tion of AGEs (Fig. 1) can occur through three major biochemi-cal mechanisms: by glycation, by the polyol pathway, and by glycoxidation.
Glycation (also known as the Maillard reaction) is a nonenzymatic process in which the glucose aldehydic group reacts with free amino-groups of a protein and forms a Schiff base. The labile Schiff base rearranges to form a sta-ble and essentially irreversista-ble Amadori product that in turn is subject to further molecular modifications before becom-ing an AGE. The most familiar intermediary glycation product measured in routine clinical practice is glycated hemoglobin.
During Amadori reorganization, reactive intermediate car-bonyl groups accumulate [6]. These compounds are known as a-dicarbonyls or oxoaldehydes and include products such as 3-deoxyglucosone and methylglyoxal. The a-dicarbonyls have the ability to react with amino, sulfhydryl, and guani-dine functional groups in proteins, resulting in denaturation, browning, and crosslinking of the targeted proteins. Primary Fig. 1. Endogenous pathways of AGE formation. Nonenzymatic reactions of the aldehydic group of reducing sugars with aminogroups of proteins produce corresponding Schiff bases, which undergo Amadori rearrangement to give ketoamines. In addition, polyol pathway, glycoxidation, and inflammation yield highly reactive carbonyl compounds, which reacting with proteins form a variety of AGEs.
2 BioFactors
40 de Maillard y la peroxidación lipídica. Además, de la reacción con los residuos de arginina para formar aductos imidazolona, MGO reacciona con residuos de proteínas de lisina para formar la carboxi-etillisina (CEL) y la reticulación imidazol, dímero de metilglioxal-lisina (MOLD). Es importante mencionar que el MGO es producido por el metabolismo de la glucosa en la memoria de las células. GO está formado por varias reacciones tales como la fragmentación oxidativa de base de Schiff (vía de Namiki), autooxidación de glucosa y la degradación, la peroxidación de lípidos, y la fragmentación de fructosa-fosfato (Singh 2001, Kumar 2004, Iram 2013, Booth 1997) (Figura 11).
Figura 11. Fuentes de especies reactivas carbonilo (RCS) y estrés carbonílico.
Los asteriscos indican posibles sitios de inhibición por los nuevos inhibidores de AGEs. (Tomada de Rahbar 2003).
De los muchos AGEs conocidos, Nϵ-(carboximetil) lisina (CML) y pentosidina son los mejor caracterizados. La CML es una molécula relativamente inerte y se usa comúnmente como un marcador de AGEs en el análisis de alimentos. La pentosidina es un producto de glicooxidación derivado de la ribosa de los residuos de arginina y lisina; es un marcador bien aceptado de daño Carbonyl stress
Carbonyl stress (Fig. 2) is an imbalance of reactive carbonyl species (RCS) production and carbonyl sca-vening mechanisms that originate from a multitude of mechanistically related pathways, like glycation [10,51,52], autooxidation of sugars [53], amino acid me-tabolism [51], lipid peroxidation [54], and UV damage [49]. An important step in the glycation reactions is the generation of reactive intermediate products in the course of all stages and pathways of glycation. These com-pounds are known as a-dicarbonyls (a-oxaloaldehyde) and include such products as 3-deoxyglucosone (3-DG), glyoxal (GO) and methylgoxal (MGO). 3-DG is formed by non-oxidative rearrangement and hydrolysis of Amadori product and by fructose-3-phosphate, an in-termediate of polyol pathway. 3-DG rapidly reacts with protein amino groups to form AGE such as imidazolone, pyrraline, and CML [10,54,55]. MGO may be produced by non-enzymatic pathways from spontaenous decom-position of triose phosphates, autoxidation of carbohy-drates and glucose degradation, and also by several minor metabolic pathways, including the Maillard reac-tion and lipid peroxidareac-tion [10,56–58]. In addireac-tion to reaction with arginine residues to form imidazolone ad-ducts, MGO reacts with lysine residues in protein to form CEL and the imidazolium crosslink, methylglyoxal-ly-sine dimer (MOLD) [58,59]. It is noteworthy that MGO is produced by most glucose metabolizing cells. GO is formed from several reactions such as oxidative frag-mentation of Schiff!s base (Namiki pathway), glucose autoxidation and degradation, lipid peroxidation, and
fructose-phosphate fragmentation [10,54,60]. Recently, a new pathway for generation of glyoxal has been described through peroxynitrite (ONOO!)-mediated oxidation of glucose [61]. Production of GO in vivo under physio-logical conditions can yield a variety of AGE such as CML, pentosidine, GOLD, GOLA, and other non-fluo-rescent AGE [54,62–65].
Under normal conditions, very little flux of a -oxoal-dehyde and fructosamine formation proceeds to form AGE because there are major alternative metabolic fates of these AGE precursors. a-Oxoaldehydes are metabolized and inactivated by enzymatic conversion to the corresponding aldonic acids, catalyzed by the glu-tathione-dependent glyoxalase system [66]. 3-DG is metabolized to 3-deoxyfructose, catalyzed by NADPH-dependent 3-DG reductase, while fructosamine is degraded to Schiff!s base adduct by reversal of the Amadori rearrangement, and to fructosamine-3-phos-phate by the ATP-dependent 3-phosphokinase [67].
Advanced glycation bya-oxoaldehydes is also decreased by reversible binding of a-oxoaldehydes to cysteinyl thiols, forming hemiothioacetal adducts [67]. The for-mation of AGE is increased when the concentrations of oxoaldehydes and fructosamine are increased. This may arise as a consequence of increased rates of formation and/or decreased rates of metabolism of a-oxoaldehydes and fructosamine [67,68]. Hyperglyce-mia, accumulation of triosephosphates and ketone bodies, lipid peroxidation, and oxidative stress may all increase the formation of AGE [10,67,68].
The accumulation of MGO and other reactive di-carbonyls from both glycoxidation and lipoxidation
Fig. 2. Sources of reactive carbonyl species (RCS) and carbonyl stress. Asterisks indicate possible sites of inhibition by novel AGE inhibitors.
66 S. Rahbar, J.L. Figarola / Archives of Biochemistry and Biophysics 419 (2003) 63–79
41 protéico acumulativo en el envejecimiento y en una variedad de estados patológicos como la DM.
Tanto la pentosidina como la CML tienen propiedades fluorescentes que permiten su detección en la circulación y en el tejido (Fishman 2018).
Las alteraciones estructurales dicarbonílicas inducidas en proteínas son tema importante de investigación debido a su papel en la formación de AGEs (Iram 1997).
La glicación de proteínas interfiere con sus funciones normales al alterar la conformación molecular, alterar la actividad enzimática, reducir la capacidad de degradación e interferir con el reconocimiento del receptor. El mecanismo por el cual la glicación altera las funciones celulares incluye la desnaturalización y el declive funcional de las proteínas diana y los lípidos, la organopatía debida a la acumulación de AGEs en el tejido, la activación de la vía de señal mediada por receptores en las células, la generación de estrés oxidativo y el estrés carbonílico (Singh 2014).
Si bien la acción patológica de los AGEs se centra en la modificación estructural y funcional que su formación conlleva (la hemoglobina glicada HbA1c presenta una menor afinidad hacia el oxígeno, que la nativa), y su interacción con sus receptores específicos (conocidos como RAGEs) no solo induce un proceso pro-inflamatorio e incrementa el estrés oxidativo. Adicionalmente, se ha observado también que los AGEs inducen la apoptosis celular. Así pues, su formación implica el impulso de una cascada de eventos que se imbrican entre ellos y que irremediablemente concluyen con el desarrollo de patologías (Nowotny 2015).
La tasa fisiológica normal de acumulación de AGEs aumenta con la edad, pero aumenta además en presencia de hiperglucemia, estrés oxidativo e inflamación. La producción y acumulación de AGEs son estimuladas por una variedad de factores, entre ellos el tabaquismo, los metales de transición y los agentes reductores. Los AGEs exógenos se encuentran en niveles altos en la dieta occidental moderna, como resultado de los métodos de procesamiento de alimentos que incluyen la esterilización, el microondas y la parrilla. Esto es consistente con el hallazgo de que los niveles de AGEs circulantes son más altos en la población del mundo occidental (Fishman 2018).
Los AGEs interactúan con RAGEs (receptor for advanced glycation end product), que es el receptor más bien caracterizado para los AGEs. Estos son proteínas transmembrana que forman parte de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Goldin 2006). RAGE se expresa en una amplia gama de tipos de células: vasculares, células inflamatorias, células epiteliales glomerulares (podocitos), neuronas del sistema nervioso central y periférico, cardiomiocitos, células
42 ganglionares retinianas de Müller y neumocitos alveolares. En la homeostasis, RAGE generalmente se expresa en niveles bajos en tejidos adultos sanos; en entornos tales como enfermedades cardiovasculares, diabetes, inflamación, tumores y neurodegeneración, la expresión de RAGE es más alta que la observada en el control, modelos animales no enfermos o sujetos sanos. RAGE se regula en respuesta a un aumento de los niveles de AGEs circulante, la unión AGE-RAGE (Daffu 2013, Kay 2016). La interacción de los AGE-RAGE genera estrés oxidativo, producción de citoquinas inflamatorias y diferenciación osteoblástica en el endotelio vascular (Nicoll 2017).
3.3.1.1. AGEs y calcificación vascular
El grado de formación de AGEs in vivo es proporcional a la disponibilidad de sustrato (es decir, monosacáridos), así como a la tasa de recambio de proteínas. Las proteínas de larga vida con un contenido significativo de lisina y arginina (por ejemplo, colágeno y elastina) son particularmente susceptibles a la glicación (Singh 2014, Fishman 2018). El deterioro estructural del colágeno altera la diferenciación de los osteoblastos que conduce a la remodelación ósea y la fragilidad esquelética (Alikhani 2007 y Saito 2006). La reticulación intermolecular del colágeno causada por los AGEs disminuye la compliance arterial y miocárdica, aumenta la rigidez vascular, la disfunción diastólica y la hipertensión sistólica (Cooper 2001).
En pericitos microvasculares bovinos, los AGEs tienen la capacidad de acelerar la diferenciación osteoblástica, lo que podría contribuir al desarrollo de la calcificación vascular en diabetes (Yamagishi 2002). También, se ha demostrado una asociación entre los niveles séricos de AGEs y la aceleración de la CV al promover la diferenciación de CVML de rata a través de la vía RAGE/estrés oxidativo, en diabetes (Ren 2009, Tanikawa 2009, Wei 2013). Por otro lado, Baidoshvili y cols. encontraron en pacientes con DM, acumulados en sitios de calcificación en válvulas aórticas degeneradas y en arterias torácicas internas, una estructura antigénica principal de los AGEs no reticulantes N (épsilon)-(carboximetil) lisina (CML) (Baidoshvili 2004); y una correlación positiva entre los niveles de AGEs y la gravedad de la calcificación de la arteria coronaria en pacientes en hemodiálisis (Taki 2006).
Tras la unión AGE-RAGE, se activan funciones básicas para RAGE en la calcificación de CVML a través de la señalización de la proteína quinasa CZ (PKC- ζ), para desencadenar la activación de una cascada de señalización que funciona a través de la proteína quinasa activada por
43 mitógeno p38 (MAPK), el factor de crecimiento transformante β (TGF-β) y el factor nuclear κB (NF-κB) (Sakaguchi 2011, Geraldes 2010), aumento de la expresión de FA y disminución de la expresión de los marcadores de genes de CVML, como la cadena pesada de miosina de músculo liso (SM-MHC) y 22 α de músculo liso (SM22 α ) (Suga 2011).
Es importante señalar que mientras la señalización AGE-RAGE puede mediar directamente la calcificación vascular en la diabetes, la señalización AGE-RAGE también puede impactar indirectamente en las complicaciones diabéticas (Wei 2013, Tanikawa 2009).
Figura 12: Los niveles de glucosa persistentemente elevados durante la diabetes de larga duración inducen cambios estructurales y funcionales en diferentes proteínas del cuerpo, como la albúmina, las globulinas, el fibrinógeno y el colágeno. La glicación de estas proteínas se asocia a la inducción de cambios perjudiciales en el cuerpo (Singh 2014).
3.3.1.2. AGEs, diabetes mellitus y sus complicaciones
Se ha demostrado que los pacientes con DM tipo 2 tienen una concentración significativamente mayor de AGEs que la población no diabética y que los AGEs se encuentran entre los factores responsables de sus complicaciones vasculares (Sttit 1997, Sttit 1998, Singh 2001, Giacco 2010, Kay 2016). Los niveles altos de glucosa pueden inducir la glicación de varias proteínas
2 VP Singh, et al
Fig. 1. Persistently elevated glucose levels during long standing diabetes induce structural and functional changes in different protein in the body including albumin, globulins, fibrinogen and collagens. Glycation of these proteins is associated with induction of deleterious changes in the body.
Fig. 2. Formation of advanced glycation end products in three stages i.e., early, intermediate and late stage involving (AGEs). In an early stage, sugars react with a free amino group to form Schiff base which undergoes a rearrangement to a more stable product known as amadori product. In an intermediate stage, amadori product degrades to a variety of reactive dicarbonyl compounds.
In the late stage of the glycation process AGEs (irreversible com-pounds) are formed.
in smokers with concurrent increase in inflammatory mark-ers [10]. There is evidence from animal studies that ex-posure to high levels of exogenous AGEs contributes to re-nal and vascular complications [11]. AGEs often accumu-late intracellularly [12] as a result of their generation from glucose-derived dicarbonyl pre cursors [13]. These intra-cellular AGEs play important roles as stimuli for activating intracellular signaling pathways as well as modifying the function of intracellular proteins [14]. AGEs accumulate in most sites of diabetes complications, including the kidney, retina, and atherosclerotic plaques [15]. Glycation of pro-teins interferes with their normal functions by disrupting molecular conformation, altering enzymatic activity, re-ducing degradation capacity, and interfering with receptor recognition [16]. The mechanism by which glycation alter-sthe cell functions include denaturation and functional de-cline of the target protein and lipid, organopathy due to accumulation of AGEs in tissue, activation of receptor- mediated signal pathway in cells, generation of oxidative stress and carbonyl stress [17]. The intermolecular collagen cross-linking caused by AGEs leads to diminished arterial and myocardial compliance, increased vascular stiffness in-crease, increase in diastolic dysfunction and systolic hyper-tension [18]. Turk and his co-workers reported that the presence of autoantibodies against serum AGEs are capable of forming AGE-immune complexes in diabetic patients and may play a role in atherogenesis [19]. Glycation-derived free radicals can cause protein fragmentation and oxidation of nucleic acids and lipids [20]. The amino groups of adenine and guanine bases in DNA are also susceptible to glycation and AGE formation [21]. The present review discusses the glycation of proteins such as albumin, fibrinogen, globulins and collagen to form different types of AGEs. Furthermore, the role of AGEs in the pathogenesis of diabetic complica-tions including retinopathy, cataract, neuropathy, nephrop-athy and cardiomyopnephrop-athy is also discussed.