TESIS DOCTORAL 2019
DIABETES MELLITUS Y CALCIFICACIÓN VASCULAR: FACTORES DE RIESGO,
BIOMARCADORES Y PAPEL DEL FITATO COMO INHIBIDOR
Rosmeri Rivera Irigoín
TESIS DOCTORAL 2019
Programa de Doctorado en Investigación Traslacional en Salud Pública y Enfermedades de Alta Prevalencia
DIABETES MELLITUS Y CALCIFICACIÓN VASCULAR:
FACTORES DE RIESGO, BIOMARCADORES Y PAPEL DEL FITATO COMO INHIBIDOR
Rosmeri Rivera Irigoín
Director : Félix Grases Freixedas Director : Lluis Masmiquel Comas Directora: Pilar Sanchis Cortés Tutor : Rafael Prieto Almirall
Laboratorio de Investigación en Litiasis Renal y Biomineralización
Instituto Universitario de Investigación en Ciencias de la Salud (IUNICS-IdISBa)
Instituto de Investigación Sanitaria Illes Balears (IdISBa) Hospital Universitario Son LLàtzer
Doctora por la Universitat de les Illes Balears
II Dr. Felix Grases Frexiedas, Catedrático del Departamento de Química de la Universidad de las Illes Baleares.
Dr Lluis Masmiquel Comas, jefe del Servicio de Endocrinología y Nutrición.
Hospital Universitario Son Llátzer.
Dra Pilar Sanchis Cortés, Profesora asociada de Química de la Universidad de las Illes Baleares. Técnico superior de soporte metodológico del IDISBA.
DECLARAN:
Que la tesis doctoral que lleva por título DIABETES MELLITUS Y CALCIFICACIÓN VASCULAR: FACTORES DE RIESGO, BIOMARCADORES Y PAPEL DEL FITATO COMO INHIBIDOR, presentada por Rosmeri Rivera Irigoín para la obtención del título de doctor, ha sido dirigida bajo mi supervision.
Y para que quede constancia de ello firmo este documento.
Dra Pilar Sanchis Cortés Dr Félix Grases Freixedas
Directora de Tesis Director de Tesis
Dr Lluís Masmiquel Comas
Director de Tesis
Palma de Mallorca, 08 de mayo del 2019
III
“Cuanto más vivo, más aprendo. Cuanto más aprendo, más me doy cuenta de lo poco que sé”
Michel Legrand
“Esfuérzate y se valiente; no temas ni desmayes, porque Jéhova, tu Dios, estará contigo dondequiera que vayas”
Josué 1:9
IV
A mis padres:
Angélica Irigoín Tantaleán Lizardo Rivera Campos
Por enseñarme el valor de la vida. Por conducirme y educarme de la manera más agradable desde mi niñez. Por hacer mi vida feliz, por darme un hogar donde solo pude recibir amor y alegría.
Porque sus vidas son mi más grande inspiración y la motivación para cristalizar todos mis sueños.
A mis hermanos:
Césil, Edgar, Edinson, Robin, Lilian, Luis y Edson; porque siempre puedo contar con ellos.
A la mamá Chela y mi abuelita Josefa: con mucho cariño
y admiración.
V
AGRADECIMIENTOS
- Al Doctor Lluís Masmiquel Comas. Sería injusto reconocerle en el agradecimiento, únicamente como director de esta tesis. Su ayuda va mucho más allá, ha sido y es un apoyo constante en mi formación como profesional de la endocrinología. Por ser mi mentor y poner en mí la motivación de la investigación y seguir aprendiendo siempre. Faltan palabras para agradecer las interminables horas dedicadas a convertirme en mejor profesional, científica y persona.
Además, agradezco infinitamente toda la confianza que ha depositado en mí durante estos años.
- A la Doctora Pilar Sanchis, por su inestimable y desinteresado apoyo, por su ayuda constante y muchas veces en horarios fuera de trabajo. Porque es un fluir de ideas que, sin ellas, la elaboración de este manuscrito hubiera sido imposible.
- Al Doctor Félix Grases Freixedas, por la labor desempeñada en la dirección de esta tesis. Su experiencia, rigor científico y espíritu crítico han sido de gran importancia para la realización de este estudio. Además, hacer mención a su trayectoria investigadora que realmente para mí, es motivo de inspiración.
- A la Doctora Joana Nicolau Ramis, porque no solo es compañera de trabajo sino también amiga y mentora. Por formarme, enseñarme y ayudarme en todos mis proyectos tanto personales como profesionales.
- A la Dra Regina Fortuny Marqués, por ser nuestro pilar en el laboratorio, tanto en las determinaciones analíticas como en la conservación de las muestras, que nos han servido para poder realizar los estudios del presente trabajo.
- Al Doctor Francisco Berga Montaner, por su desinteresado apoyo en la determinación de las muestras en el Laboratorio de UIB/IUNICS.
- A la Doctora Carmen Martínez jefe del Servicio de Radiología y al Doctor Miguel Mas, facultativos del Servicio de Radiología por su colaboración y ayuda en la cuantificación de la calcificación aórtica abdominal en los estudios radiológicos.
VI - A la Señora Luisa Ayala Corao, Licenciada en Nutrición, por su ayuda en la elaboración de la dieta, la realización de las encuestas nutricionales y el seguimiento de los pacientes durante el estudio.
- Con especial afecto, a los Doctores Luis Alberto Gómez Gómez, Irene Rodríguez Rodríguez, y Josefina Olivares Alcolea, del Servicio de Endocrinología y Nutrición del Hospital Universitario Son Llàtzer, por su apoyo durante el desarrollo de este proyecto.
- A la Señora María José Muñiz Verger, Auxiliar de Enfermería, por participar desinteresadamente dándome apoyo tanto en la visita a los pacientes del estudio como en la recolección y conservación de las muestras.
- A la Señora Margarita Ques Mayol, secretaria del Servicio de Endocrinología y Nutrición del Hospital Universitario Son Llátzer, por su ayuda desinteresada en la programación de las visitas de los pacientes del estudio.
- Al Doctor Rafael Prieto Almirall, por la labor de supervisión realizada en calidad de tutor de esta tesis.
- Agradecimiento especial a la Conselleria d’Innovació, Recerca i Turisme, por haber contribuido financiando parte de nuestro proyecto.
- Finalmente no quiero dejar de agradecer a Dios por acompañarme y ayudarme en mis momentos difíciles. Enseñarme a seguir siempre adelante y buscar concretar todos mis sueños.
VII TABLA DE ABREVIATURAS
Abreviaturas más frecuentemente utilizadas
AdipoR1: proteína 1 del receptor de adiponectina AFGP: Alquilformilglicosilpirrol
AGEs: Advanced glycation end products ALI: Imidazol arginina-lisina
ALK: receptor de quinasa similar a la activina AMPK: Adenosín monofosfato
ANK: Anquilosis progresiva APN: La adiponectina BAP: Fosfatasa alcalina ósea BMP: Bone Morphogenetic Proteins BMPRII: Receptor de BMP tipo II CAA: Calcificación arterial abdominal CAC: Calcificación arterial coronaria CAVD: Valvulopatía aórtica
Cbfa-1: Factor de unión del núcleo de transcripción alfa-1 CML: N-carboximetil-lisina
CUA: Arteriolopatía urémica calcificante CV: Calcificación vascular
CVC: Célula vascular calcificante CVi: Calcificación vascular de la íntima CVm: Calcificación vascular medial CVML: Células del músculo liso vascular DM2: Diabetes mellitus tipo 2.
DMO: densidad mineral ósea
DTPA: Ácido dietilentriaminopentaacético ECV: Enfermedad cardiovascular
eGFR: Tasa de filtrado glomerular ELR: Laminina/elastina
ERC: Enfermedad renal crónica.
ERK: una de las vías MAPK
VIII ESRD: Enfermedad renal en etapa terminal
FA: Fosfatasa alcalina
FGF23: factor de crecimiento de fibroblastos 23 GFAP: Proteína ácida fibrilar glial
H & E: Hematoxilina-eosina HbA1c: Hemoglobina glicosilada IKK: cinasas de los inhibidores IL-6: La interleucina 6
IL: Interleukina
IP6: El hexafosfato de mioinositol (fitato) JAK: Janus quinasas
MAPK: de las siglas en inglés Mitogen-Activated Protein Kinases, o proteína quinasas activadas por mitógenos.
MEC: Matriz extracelular MEI: Membrana elástica interna MGO: Metylglioxal
MGP: Proteína Gla de la matriz
MMP: Las metaloproteinasas de matriz Msx2 aórtica
Msx2-Wnt8
NF-κB: factor de transcripción nuclear kappa B NO: Óxido nítrico
NPP: Pirofosfatasa/fosfodiesterasa OC: osteocalcina
OPG: Osteoprotegerina OPN: Osteopontina
Rasp21: El activador de la proteína RASp21 o RasGAP (proteína activadora de Ras GTPasa) p38: una de las vías MAPK
PAD: Presión arterial diastólica PI3K: Vía de señalización intracelular.
PKC-ζ ó PKMz o PKMzeta: Proteína quinasa Mζ. Isoforma atípica de la proteína kinasa C (PKC).
PMO: proteínas denominadas moduladoras osteogénicas ó morfogenéticas PNP: Polineuropatía periférica
PPi: Fosfato inorgánico
IX RAGE : Receptores de AGEs
RANKL: ligando del receptor activador del factor nuclear RD: Retinopatía diabética
Rho GTP (guanosina trifosfatasa) asas: transductora de señales de estrés.
RI: Resistencia a la insulina
ROS: Especies reactivas de oxígeno
RUNX2: Factor de transcripción relacionado con Runx 2 (u homeobox 2 msh (MSX-2)
SAPK / JNK MAPK: Las proteínas quinasas activadas por estrés (SAPK)/ Jun amino-terminal quinasas (JNK) son miembros de la familia MAPK.
SMAD: son homólogas tanto de la proteína de la mosca Drosophila, la proteína MAD (por su siglas en inglés Mothers Against Decantaplegic, donde "decantapléjico" se refiere a una proteína de la mosca homóloga a la proteína morfogénica ósea humana) y la proteína de la especie de nemátodos Caenorhabditis elegans SMA (del gen ''sma'' de la palabra "small", cuerpo pequeño en vista de su capacidad de alterar el tamaño corporal). El nombre es una fusión de las dos.
sRAGE: Receptor soluble de AGEs
STAT: Transductor de señal y activador de proteínas de transcripción TGFβ: Factor de crecimiento transformante β
TNF-α: El factor de necrosis tumoral alfa TNF: Factor de necrosis tumoral
TRAIL: Ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral VEGF: Factor vascular de crecimiento endotelial
INDICE
1. ÍNDICE
2. RESUMEN 1
3. INTRODUCCIÓN GENERAL 8
3.1. Calcificaciones vasculares 13
A. Estructura de los vasos 14
B. Tipos de calcificación 15
i. Calcificación de la túnica íntima 16
ii. Calcificación de la túnica media 17
3.1.1. Calcificación vascular y enfermedades relacionadas 21 3.1.2. Calcificación vascular y diabetes mellitus tipo 2 22 3.1.3. Calcificación vascular y enfermedad renal 23
3.1.4. Calcificación valvular cardíaca 24
3.1.5. Calcificación vascular y osteoporosis 26
3.2. Mecanismos implicados en la patogénesis de la calcificación vascular 29
3.2.1. Vesículas extracelulares, vesículas de matriz y apoptosis 29
3.2.2. Degradación de la elastina 31
3.2.3. Metabolismo del fósforo y del calcio 31
3.2.4. Niveles de vitamina D y hormona paratiroidea 35
3.3. Promotores de la calcificación vascular 35
3.3.1. Productos finales de glicación avanzada (AGEs) 38
3.3.1.1. AGEs y calcificación vascular 42
3.3.1.2. AGEs, Diabetes Mellitus y sus complicaciones 45
3.3.1.2.1. Nefropatía diabética 45
3.3.1.2.2. Retinopatía diabética 47
3.3.1.2.3. Neuropatía diabética 50
3.3.1.2.4. Cardiopatía isquémica y ateroesclerosis 51
3.3.2. Inhibidores de la formación de AGEs 54
3.3.3. Mecanismos de inhibición 55
3.4. Biomarcadores de calcificación vascular 58
3.4.1. Proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) 58
3.4.2. Interleucina 6 (IL - 6) 61
3.4.3. Osteoprotegerina (OPG) 62
3.4.4. Adiponectina 64
3.4.5. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) 65
3.5. Inhibidores de la calcificación: polifosfatos 66
3.5.1. Pirofosfato 66
3.5.2. Bifosfonatos 69
3.5.3. Fitato 71
4. OBJETIVOS GENERALES 74
5. MATERIAL Y MÉTODOS 76
5.1. Estudio transversal para evaluar la relación entre los niveles de los productos finales de glicación avanzada, biomarcadores óseos e inflamatorios y la calcificación abdominal aórtica en pacientes
con diabetes mellitus tipo 2 78
5.1.1. Diseño del estudio y pacientes 78
5.1.2. Mediciones de laboratorio 79
5.1.3. Placa de columna lumbar lateral 81
5.1.4. Análisis estadístico 83
5.2. Ensayo aleatorizado cruzado para evaluar si el fitato disminuye los productos finales de glicación avanzada en pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 85
5.2.1. Estudio in vitro de la formación de AGEs 85
5.2.2. Estudio cruzado aleatorizado de pacientes con DM2 85
5.2.2.1. Sujetos y diseño del estudio 85
5.2.2.1.1. Intervención dietética 86
5.2.2.1.2. Resultados de las variables 85
5.2.2.1.3. Determinación de los AGEs 88
5.2.2.1.4. Estimación del consumo de IP6 88
5.2.2.1.5. Medición de IP6 urinario en orina de 2h 89
5.2.2.2. Seguridad y eventos adversos 90
5.2.2.3. Análisis estadístico 91
5.2.2.4. Consideraciones éticas 91
6. RESULTADOS 93
6.1. Estudio transversal para evaluar la relación entre los niveles de los productos finales de glicación avanzada y la calcificación abdominal
aórtica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 94
6.1.1. Características basales de los participantes 94
6.1.2. Uso de medicamentos 94
6.1.3. Parámetros de análisis de laboratorio 97
6.1.4. Calcificación abdominal aórtica y niveles de AGEs 99 6.1.5. Factores asociados a la calcificación abdominal aórtica (CAA) 100
6.2. Estudio transversal para evaluar la relación entre los niveles de biomarcadores óseos e inflamatorios y la CAA en pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 103
6.2.1. Características clínicas, analíticas de los sujetos y
distribución de la calcificación abdominal aórtica (CAA) 103 6.2.2. Comparación de la severidad de la CAA entre grupos 106 6.2.3. Relación entre los biomarcadores y la severidad de la CAA 107
6.3. Ensayo aleatorizado cruzado para evaluar si el fitato disminuye los productos finales de glicación avanzada en pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 114
6.3.1. Efecto del IP6 en la formación de AGEs in vitro 114 6.3.2. Efecto de la dieta IP6 en pacientes con DM2 116 6.3.2.1. Características basales de los pacientes 116 6.3.2.2. Efecto de la dieta IP6 en AGEs, HbA1c y otras variables 119 6.3.2.3. Efecto de la dieta IP6 sobre la excreción urinaria de IP6 123
6.3.2.4. Seguridad y eventos adversos 124
7. DISCUSIÓN 125
7.1. Estudio transversal para evaluar la relación entre los niveles de los productos finales de glicación avanzada y la calcificación abdominal
aórtica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 126
7.2. Estudio transversal para evaluar la relación entre los niveles de biomarcadores óseos e inflamatorios y la CAA en pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 130
7.1. Ensayo aleatorizado cruzado para evaluar si el fitato disminuye los productos finales de glicación avanzada en pacientes con
diabetes mellitus tipo 2 136
8. CONCLUSIONES GENERALES 140
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 144
10. ANEXOS 183
1
2. RESUMEN
2 RESUMEN
INTRODUCCIÓN: La calcificación vascular (CV) es una enfermedad muy prevalente en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DM2) en comparación con la población no diabética. Sin embargo, su patogenia no se entiende completamente. Evidencias sugieren que la calcificación en DM2 es un proceso activo, donde participan diferentes factores (promotores e inhibidores), los cuales pueden acelerar o ralentizar el proceso natural de calcificación. Parece ser que este proceso está mediado por células, en el que la hiperglucemia, los productos finales de glicación avanzada (AGEs, advance glycation end products) y los marcadores óseos e inflamatorios participan en su inicio y progresión. Por otro lado el myo-inositol hexafosfato (fitato; IP6) es un compuesto natural (que se encuentra en abundancia en cereales, legumbres y frutos secos) que tiene la capacidad de interaccionar con cationes metálicos. Algunos cationes metálicos actúan como catalizadores en la glicación protéica no enzimática, cuyos productos finales (los AGEs), están implicados en el desarrollo de las enfermedades asociadas a la diabetes.
OBJETIVOS: Los objetivos principales de esta tesis fueron: (1) determinar la relación entre los AGEs y la calcificación abdominal aórtica (CAA) en pacientes con DM2, (2) determinar la relación entre los biomarcadores óseos e inflamatorios y la CAA en pacientes con DM2; (3) evaluar “in vitro” el efecto inhibidor del IP6 sobre la formación de AGEs; y (4) valorar el efecto de una ingesta adecuada de IP6 (1 g/día) sobre la formación de los AGEs y la hemoglobina glicosilada (HbA1c) en pacientes con DM2.
MÉTODOS: Para evaluar el objetivo (1) y (2) desarrollamos un estudio observacional de corte transversal en el que se reclutaron consecutivamente 104 pacientes con DM2 a los que se les realizaron radiografías lumbares laterales para cuantificar la CAA (puntuación de 0-24 puntos) y se determinaron las concentraciones de hemoglobina glicosilada (HbA1c), de AGEs (ELISA), de la proteína morfogénica ósea (Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)) BMP-2 e interleucina 6 (IL- 6) y otros factores de riesgo cardiovascular en muestras de sangre. El objetivo (3) se evaluó con un estudio “in vitro” mediante la incubación a 37ºC de una mezcla de ribosa (0.2 M), acetil lisina (2 mM), acetil arginina (1 mM), cationes hierro (III) (2 µM) y diferentes concentraciones de IP6 (0-2 µM) durante 7 días con las posteriores determinaciones de los AGEs formados por fluorescencia (λexc 320 nm; λem 360-540 nm). Se realizó, además, un ensayo clínico aleatorizado cruzado de dos brazos, para evaluar el objetivo (4) en el que se reclutaron 33 pacientes con DM2. Uno de los brazos de tratamiento consistía en una dieta rica en IP6 mediante la suplementación oral de 1.140mg/día de IP6 durante 3 meses. El otro brazo consistía en una dieta pobre en IP6 sin suplementación. Después de 3 meses, a cada grupo se le dio un
3 período de lavado de 3 meses, y luego se cambió al otro brazo de tratamiento durante 3 meses más seguidos de 3 meses de seguimiento. Al inicio y al final de cada periodo se determinó los AGEs, la HbA1c, el IP6 en orina y otros parámetros clínicos y de laboratorio.
RESULTADOS: Nuestros resultados indican que los sujetos con mayor puntuación de CAA tienen niveles más altos de AGEs circulantes (r = 0,784, p <0,001), BMP-2 (r = 0,579, p <0,001) e IL-6 (r = 0,388, p <0,001). Nuestro estudio “in vitro” demostró que el IP6 a concentraciones fisiológicas redujo la formación de AGEs de manera que a una concentración de 2µM produjo una inhibición del 19,9%. Además, en el ensayo clínico, observamos un descenso de HbA1c (- 0,38%; p=0,029) y AGEs (-25,6%; p < 0,001) al final del tratamiento con IP6, con recuperación de niveles basales tras el periodo de lavado. Estos cambios se asociaron a un aumento significativo en la excreción urinaria de IP6 (0,34 ± 0,04 a 0,50 ± 0,05 mg/g de creatinina; p <
0,05).
CONCLUSIONES: Los resultados indican que los AGEs están relacionados con el proceso de calcificación y los plantean como inductores potenciales. Asimismo, nuestros datos sugieren que la calcificación vascular en la DM2 es un proceso multifactorial en el que la hiperglucemia, los eventos inflamatorios e inmunológicos podrían desempeñar un papel central en su inicio y progresión.
4 RESUM
INTRODUCCIÓ: La calcificació vascular (CV) és una malaltia molt prevalent en pacients amb diabetis mellitus tipus 2 (DM2) en comparació amb la població no diabètica. No obstant això, la seva patogènia no s'entén completament. Noves evidències suggereixen que la calcificació en DM2 és un procés actiu, on participen diferents factors (promotors i inhibidors), els quals poden accelerar o relentir el procés natural de calcificació. Sembla ser que aquest procés està mediat per cèl·lules, en què la hiperglucèmia, els productes finals de glicació avançada (AGEs, advance glycation end products) i els marcadors ossis i inflamatoris participen en el seu inici i progressió.
D'altra banda el myo-inositol hexafosfat (fitat; IP6) és un compost natural (que es troba en abundància en cereals, llegums i fruits secs) que té la capacitat d'interaccionar amb cations metàl·lics. Alguns cations metàl·lics actuen com a catalitzadors en la glicació proteica no enzimática i els seus productes finals (els AGEs) estan implicats en el desenvolupament de les malalties associades a la diabetis.
OBJECTIUS: Els objectius principals d'aquesta tesi van ser: (1) determinar la relació entre els AGEs i calcificació abdominal aòrtica (CAA) en pacients amb DM2; (2) determinar la relació entre els biomarcadors ossis i inflamatoris i la CAA en pacients amb DM2; (3) avaluar "in vitro" l'efecte inhibidor del IP6 sobre la formació d'AGEs; i (4) valorar l'efecte d'una ingesta adequada de IP6 (1 g / dia) sobre la formació dels AGEs i l'hemoglobina glicosilada (HbA1c) en pacients amb DM2.
MÈTODES: Per avaluar l'objectiu (1) i (2) desenvoluparem un estudi observacional de tall transversal en el qual es van reclutar consecutivament 104 pacients amb DM2 en el quals se'ls van realitzar radiografies lumbars laterals per quantificar la CAA (puntuació de 0-24 punts) i es van determinar les concentracions d'hemoglobina glicosilada (HbA1c), de AGEs (ELISA), de la proteïna morfogènica òssia (Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)) BMP-2 i interleucina 6 (IL-6) i altres factors de risc cardiovascular en mostres de sang. L'objectiu (3) es va avaluar amb un estudi "in vitro" mitjançant la incubació a 37ºC d'una mescla de ribosa (0.2 M), acetil lisina (2 mM), acetil arginina (1 mM), cations ferro (III) (2 µM) i diferents concentracions de IP6 (0-2 µM) durant 7 dies amb les posteriors determinacions dels AGEs formats per fluorescència (λexc 320 nm; λem 360-540 nm). Es va realitzar, a més, un assaig clínic aleatoritzat creuat de dos braços, per avaluar l'objectiu (4) en el qual es van reclutar 33 pacients amb DM2. Un dels braços de tractament consistia en una dieta rica en IP6 mitjançant la suplementació oral de 1.140mg / dia de IP6 durant 3 mesos. L'altre braç consistia en una dieta pobra en IP6 sense suplementació.
Després de 3 mesos, a cada grup se li va donar un període de rentat de 3 mesos, i després es
5 va canviar a l'altre braç de tractament durant 3 mesos més seguits de 3 mesos de seguiment. A l'inici i al final de cada període es va determinar els AGEs, l'HbA1c, el IP6 en orina i altres paràmetres clínics i de laboratori.
RESULTATS: Els nostres resultats indiquen que els subjectes amb major puntuació de CAA tenen nivells més alts de AGEs circulants (r = 0,784, p <0,001), BMP-2 (r = 0,579, p <0,001) i IL- 6 (r = 0,388, p <0,001). El nostre estudi “in vitro” va demostrar que l’IP6 a concentracions fisiològiques va reduir la formació de AGEs de manera que a una concentració de 2µM va produir una inhibició del 19,9%. A més, en l'assaig clínic, observam un descens de l’HbA1c (- 0,39%, p = 0,029) i dels AGEs (-25,6%; p <0,001) al final del tractament amb IP6, amb recuperació de nivells basals després del període de rentat. Aquests canvis es van associar a un augment significatiu en l'excreció urinària d'IP6 (0,34 ± 0,04 a 0,50 ± 0,05 mg / g de creatinina; p
<0,05).
CONCLUSIONS: Els resultats indiquen que els AGEs estan relacionats amb el procés de calcificació i els plantegen com a inductors potencials. Així mateix, les nostres dades suggereixen que la calcificació vascular en la DM2 és un procés multifactorial en el qual la hiperglucèmia, els esdeveniments inflamatoris i immunològics podrien tenir un paper central en el seu inici i progressió.
6 ABSTRACT
INTRODUCTION: Vascular calcification (CV) is a very prevalent disease in patients with diabetes mellitus type 2 (DM2) compared to the non-diabetic population. However, its pathogenesis is not fully understood. Evidence suggests that calcification in DM2 is an active process, involving different factors (promoters and inhibitors), which can accelerate or slow down the natural process of calcification. It seems that this process is cell-mediated, in which hyperglycemia, advanced glycation end products (AGEs) and bone and inflammatory markers participate in its onset and progression. On the other hand, myo-inositol hexaphosphate (phytate, IP6) is a natural compound (that is found in abundance in cereals, legumes and nuts) which has the ability to interact with metal cations. Some metallic cations act as catalysts in non-enzymatic protein glycation, whose final products (AGEs) are involved in the development of diseases associated with diabetes.
OBJECTIVES: The main objectives of this thesis were: (1) to determine the relationship between AGEs and abdominal aortic calcification (AAC) in patients with DM2; (2) to determine the relationship between bone and inflammatory biomarkers and AAC in patients with DM2; (3) to evaluate "in vitro" the inhibitory effect of IP6 on the formation of AGEs; and (4) assess the effect of an adequate intake of IP6 (1 g / day) on the formation of AGEs and glycosylated hemoglobin (HbA1c) in patients with DM2.
METHODS: To evaluate objective (1) and (2) we developed an observational cross-sectional study in which 104 patients with DM2 were enrolled consecutively, in whom lateral lumbar radiographs were performed to quantify the CAA (score of 0-24 points) and the concentrations of glycosylated hemoglobin (HbA1c), AGEs (ELISA), bone morphogenic protein (Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)) BMP-2 and interleukin 6 (IL-6) and other cardiovascular risk factors were determined in samples of blood. Objective (3) was evaluated with an "in vitro" study by incubation at 37°C of a mixture of ribose (0.2 M), acetyl lysine (2 mM), acetyl arginine (1 mM), iron (III) cations (2 µM) and different concentrations of IP6 (0-2 µM) for 7 days with the subsequent determinations of the formed AGEs by fluorescence (λexc 320 nm, λem 360-540 nm). In addition, a randomized double-arm crossover trial was conducted to evaluate the objective (4) in which 33 patients with DM2 were recruited. One of the treatment arms consisted of a diet rich in IP6 by oral supplementation of 1140mg / day of IP6 for 3 months. The other arm consisted of a diet poor in IP6 without supplementation. After 3 months, each group was given a 3-month washout period, and then switched to the other treatment arm for 3 more months
7 followed by 3 months of follow-up. At the beginning and at the end of each period, AGEs, HbA1c, IP6 in urine and other clinical and laboratory parameters were determined.
RESULTS: Our results indicate that subjects with higher CAA scores have higher levels of circulating AGEs (r = 0.784, p <0.001), BMP-2 (r = 0.5379, p <0.001) and IL-6 (r = 0.388, p
<0.001). Our “in vitro” study demonstrated that the IP6 at physiological concentrations reduced the formation of AGEs so that at a concentration of 2µM it produced an inhibition of 19.9%. In addition, in the clinical trial, we observed a decrease in HbA1c (-0.39%, p = 0.029) and AGEs (- 25.6%; p <0.001) at the end of treatment with IP6, with recovery of basal levels after the period of wash-out. These changes were associated with a significant increase in urinary excretion of IP6 (0.34 ± 0.04 to 0.50 ± 0.05 mg / g of creatinine; p <0.05).
CONCLUSIONS: The results indicate that the AGEs are related to the calcification process and pose them as potential inducers. Likewise, our data suggest that vascular calcification in DM2 is a multifactorial process in which hyperglycemia, inflammatory and immunological events could play a central role in its onset and progression.
8
2. INTRODUCCIÓN GENERAL
9 INTRODUCCIÓN GENERAL
La diabetes mellitus (DM) comprende un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por hiperglucemia, resultante de defectos en la secreción o en la acción de la insulina o de ambos mecanismos (Diabetes Care 1997).
En todo el mundo, actualmente se diagnostica de diabetes mellitus tipo 2 (DM2) a 382 millones de personas, y este número se espera que alcance 600 millones en 2035 (Kharroubi 2015), convirtiendo así a la enfermedad en una epidemia (Radoi 2012).
La hiperglucemia induce el desarrollo de complicaciones relacionadas con la diabetes. Estas complicaciones pueden clasificarse en microvasculares (como son la nefropatía, retinopatía y neuropatía) y macrovasculares (arteriopatía periférica, enfermedad cerebrovascular, cardiopatía isquémica y miocardiopatía isquémica). Las complicaciones microvasculares son muy frecuentes, el 38% de los pacientes con DM2 presentan cualquier etapa de enfermedad renal crónica (ERC), casi el 30% tiene retinopatía (RD), y más del 30% tiene neuropatía periférica (PNP) (Avogaro 2019, en imprenta).
La calcificación vascular (CV) no es un fenómeno nuevo. Hay evidencia sobre su existencia en aproximadamente un tercio de las momias de la Edad Antigua hace más de 4000 años (Lee 2016).
Patológicamente, existen dos patrones de calcificación vascular el de la íntima y la media. La calcificación medial (CVm) (también llamada calcificación de Mönckeberg (MMS) o calcinosis medial) se produce inicialmente en la capa media del vaso, en particular en la lámina elástica interna y, forma una densa lámina circunferencial de cristales de calcio en el centro de la media, unida en ambos lados por células musculares lisas vasculares (CVML) y, a menudo, contiene trabéculas óseas y osteocitos. Existen varios estudios que asocian la calcificación arterial medial con la morbilidad y la mortalidad en la diabetes. La calcificación de Mönckeberg se describe más comúnmente en vasos distales de pacientes con diabetes, ERC, y edad avanzada. Además, se asocia con un aumento de mortalidad cardiovascular por todas las causas en pacientes diabéticos sin ERC, y en pacientes con ERC con y sin diabetes (Chen 2003, Shanahan 1999, Chen 2012).
También, se ha encontrado la presencia de formación ósea en placas carotídeas de pacientes con diabetes (Chen 2003). Otros autores demostraron que la calcificación arterial medial es un fuerte predictor independiente de la mortalidad por cardiopatía coronaria y cardiovascular total, y también un predictor significativo de futuros eventos de cardiopatía coronaria, accidente
10 cerebrovascular y amputación de extremidades inferiores. Esta relación se observó independientemente del control glucémico y la duración de la diabetes (Letho 1996, Everhart 1988, Leon 2015).
Está bien documentado que el aumento de la prevalencia de aterosclerosis, la enfermedad vascular y la mortalidad cardiovascular está asociada a la diabetes. Se informa que la tasa de mortalidad por enfermedad cardiovascular en un individuo de 18 años o más con diabetes es aproximadamente 1,7 veces mayor que la población normal. El aumento de las tasas de mortalidad por enfermedad cardiovascular diabética demuestra la gravedad de las complicaciones que pueden surgir de esta patología (Kay 2016). Además, algunos estudios confirman de que varios factores, como el aumento del estrés oxidativo, el aumento de la coagulabilidad, la disfunción endotelial y la neuropatía autonómica, están a menudo presentes en pacientes con DM y pueden contribuir directamente al desarrollo de enfermedad cardiovascular (ECV) (Leon 2015).
Los mecanismos que controlan la calcificación arterial medial en la DM2 pueden implicar efectos patogénicos de la hiperglucemia diabética, la resistencia a la insulina (RI), la obesidad y la dislipidemia. Las dietas ricas en grasas que inducen obesidad, diabetes resistente a la insulina y dislipidemia promueven calcificación arterial medial. La diabetes y la dislipidemia inducen estrés oxidativo, inflamación de bajo grado y angiogénesis en la adventicia de las arterias diabéticas (Chistiakov 2014). El estrés oxidativo desempeña un papel importante en la lesión tisular inducida por la hiperglucemia, así como en los primeros eventos relevantes para el desarrollo de la DM2.
La formación de AGEs, es un factor que contribuye. Por un lado se ha informado de que la formación de AGEs aumentan especies reactivas de oxígeno (ROS) y afectan los sistemas antioxidantes, por otro lado la formación de algunos AGEs se induce per se bajo condiciones oxidantes. Por lo tanto, los AGEs contribuyen al menos en parte, a las condiciones de estrés crónico en la diabetes. A medida que envejecemos, no sólo se forman endógenamente, sino que también se derivan de fuentes exógenas, por ejemplo, los alimentos. Por tal motivo, los AGEs de los alimentos han sido asumidos como factores de riesgo para la DM2 (Nowotny 2015).
La CV es una forma patológica de calcificación de tejidos blandos. Todos los biominerales están formados por los mismos principios físico-químicos, y la fuerza conductora termodinámica para la cristalización es la sobresaturación. Como consecuencia, puede plantearse la hipótesis de que cuanto mayor sea la concentración de calcio y fosfato en la sangre, mayor será el riesgo de CV.
Sin embargo, otros factores pueden acelerar o ralentizar el proceso natural de calcificación. Entre
11 la lista de promotores, además del metabolismo fosfocálcico, puede ser que los AGEs y otros receptores endógenos para ligandos AGEs tales como S100A12 puedan tener que actuar como promotores; también, varios estudios epidemiológicos han identificado biomarcadores específicos de CV (Aoki 2013, Shen 2013), proteínas endógenas, entre ellas (Bone Morphogenetic Proteins (BMPs)) BMP-2 y BMP-4, miembros de la familia del factor de crecimiento transformante que contribuyen de manera importante a la formación ósea y que también pueden expresarse en la pared vascular; ciertas citoquinas proinflamatorias comúnmente expresadas en arterias ateromatosas inflamadas, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF- α) y la interleucina 6 (IL- 6). Mientras que el pirofosfato (PP) un polifosfato natural que está presente en el suero y en la orina, y el fitato, un componente natural presente en legumbres y frutos secos, pueden prevenir la calcificación. Por otro lado, las proteínas endógenas que inhiben la CV incluyen la MGP (proteína Gla de la matriz), fetuina, osteopontina, adiponectina y osteoprotegerina (Mc Carty 2014, Giachelli 2004).
La glucosa no sólo es la fuente principal de energía para períodos cortos, sino también la principal fuente de complicaciones de la DM, mediante la oxidación y formación de los AGEs (Radoi 2012).
Los AGEs son un grupo complejo y heterogéneo de compuestos (Singh 2001). Durante la glucosilación de proteínas, los grupos amino de proteínas reaccionan con los grupos aldehídos o ceto de azúcares reductores para formar bases de Schiff que luego se convierten en compuestos relativamente estables llamados productos de Amadori a través de un reordenamiento. El proceso de glicación, antes de esta conversión, se conoce como la glicación en etapa temprana. Los compuestos de Amadori se convierten en sustancias relativamente más reactivas, tales como compuestos de dicarbonilo y 3-desoxiglucosona (3DG), que resultan en la formación de AGEs a través de la deshidratación y reordenación. La glicación de las proteínas y otras biomoléculas es un proceso que depende del tiempo y de la concentración. Durante la diabetes, la velocidad de formación de los AGEs aumenta espontáneamente debido al aumento de los niveles de glucosa en la sangre (Abbas 2016). La glicación rápida de proteínas y la formación de los AGEs conducen a la insuficiencia de varios órganos principalmente el corazón, los ojos, los riñones, los nervios y los vasos sanguíneos (Mosihuzzman 2013).
Por ello, el descubrimiento de nuevos agentes antiglicación potenciales de orígenes naturales y sintéticos con actividad inhibidora mejorada y toxicidad reducida, se considera un enfoque eficaz para la prevención de las complicaciones diabéticas (Abbas 2016).
12 El fitato o hexafosfato de myo-inositol-1,2,3,4,5,6 (InsP6) es un componente natural ampliamente distribuido en el reino vegetal. Sirve como almacén de fosfato y minerales y contiene el 75% del total del fosfato de las semillas. La fuente principal de InsP6 está en los cereales integrales, legumbres, semillas y frutos secos (Buades 2017). El InsP6, por sus características químicas, tiene tendencia a reaccionar con cationes polivalentes como el calcio, el magnesio, el zinc y el hierro (Mellanby 1949, Walker 1948). Diversos estudios describen propiedades beneficiosas para el organismo, como sus actividades antioxidantes y anticancerígenas, en la dosis correspondiente a la de la dieta mediterránea (1g/día). Al mismo tiempo, es un inhibidor de la cristalización de sales cálcicas y, por lo tanto, previene la formación de cálculos renales, presenta efectos positivos en los niveles de glucosa y colesterol en sangre y también protege frente a la osteoporosis (Berga 2016). El IP6 también tiene una alta afinidad hacia el Fe3+, siendo incluso mayor que la de EDTA, deferoxamina (DFOA) o ATP, lo que sugiere que el consumo de IP6 podría reducir la biodisponibilidad de los minerales y por lo tanto influir en la formación de los AGEs (Gupta 2015, Reddy 1996).
Claramente, la fisiopatología de la calcificación vascular en pacientes con diabetes parece ser multifactorial (Chen 2003). Por lo tanto, comprender el vínculo entre las enfermedades cardiovasculares y la diabetes es esencial para optimizar su tratamiento y mejorar la calidad de vida de nuestros pacientes. Por otro lado, el papel de los AGEs en la patogénesis de la DM2 y sus complicaciones, se entiende sólo en parte. El conocimiento de los mecanismos patogénicos involucrados es esencial para la prevención y la mejora de las complicaciones de esta enfermedad.
Esto nos motivó a estudiar:
• La asociación entre los niveles circulantes de AGEs con la calcificación abdominal aórtica y complicaciones relacionadas con la diabetes.
• Biomarcadores óseos e inflamatorios y su asociación con la calcificación abdominal aórtica en pacientes con DM2.
• El fitato como inhibidor de la glicación proteica avanzada catalizada por metales en pacientes con DM2.
13 3.1. CALCIFICACIONES VASCULARES
La CV representa un proceso patológico caracterizado por la pérdida de elasticidad de los vasos y engrosamiento de la pared del vaso como resultado de la acumulación de minerales en la capa media y/o capa de la íntima de la pared arterial. La calcificación de la íntima se produce normalmente en la aorta, arterias coronarias, y las arterias principales, y se reconoce como un indicador de la progresión de la aterosclerosis. Por otra parte, la arteriosclerosis se desarrolla como resultado de la calcificación medial. En el estudio realizado por Bostróm y cols, encontraron que la CV no es un evento pasivo y degenerativo que se desarrolla en la capa íntima o media de la arteria, sino es un proceso activo y programado (Bostróm 1993). La inflamación crónica regula los mecanismos que provocan tanto la aterosclerosis como la CV de la media. Los estudios realizados hasta ahora han demostrado la importancia de la angiogénesis en el desarrollo de CV, y han puesto de manifiesto el papel de los osteoblastos y los osteoclastos (Gungor 2018)
Como hemos dicho, la CV es un proceso activo mediado por células y, como la osteogénesis, implica la expresión de proteínas relacionadas con los huesos, como la fosfatasa alcalina (FA) y el factor 2 de transcripción relacionado con Runt (Runx2, también llamado cbf- α-1), desempeña un papel clave, ya que son iniciadores de la mineralización ósea y diferenciación de células musculares lisas (CML). La expresión de FA se ha demostrado en lesiones ateroscleróticas calcificadas. El Runx2 específico de CML desempeña un papel crítico tanto en la diferenciación osteoblástica como en la maduración de los condrocitos durante la CV inducida por aterosclerosis.
Además, el eje Wnt/b-catenina regula la expresión de Runx2, controlando así la diferenciación de los osteoblastos. En los osteoblastos, la vía Wnt/b-catenina controla la expresión de osteoprotegerina y RANKL (factor nuclear kappa-B), contribuyendo así a la regulación de los osteoclastos. Las células musculares lisas vasculares (CVML) sintetizan cantidades mucho mayores de osteoprotegerina (OPG) que las células endoteliales y desempeñan un papel significativo en la progresión de la CV, al igual que los miofibroblastos adversos y las células vasculares calcificadoras similares a los pericitos. Las lesiones calcificadas contienen muchas proteínas de la matriz ósea como colágeno tipo I, osteocalcina, osteonectina, osteopontina, proteína Gla y proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), que permiten o regulan la deposición extracelular de hidroxiapatita (Mc Carty 2014, Rochette 2018).
La calcificación de tejidos blandos o extraósea es frecuente en personas de edad avanzada, afecta al 50% de las personas entre 40-49 años y al 80% entre 60-69 años (Berga 2016).
14 La CV se asocia con un aumento de la morbilidad y mortalidad incluso en pacientes más jóvenes, y se observa con frecuencia en enfermedades como la diabetes, la hipertensión y la aterosclerosis, donde la progresión involucra daño endotelial y en individuos sanos. Los estudios epidemiológicos de pacientes con ERC han informado una incidencia de CV del 30% y 50% en los grupos de edad de 15-30 y 40-50 años, respectivamente (Gungor 2018).
En un estudio se ha estimado que la prevalencia de CVm de tipo esclerosis de Mönckeberg basado en el índice tobillo-brazo (ABI) >1,3 ocurre en alrededor de 0,5% de los adultos, es más frecuente en hombres que en mujeres (3: 2) y la mayor prevalencia de CVm se ha observado en pacientes con DM2, siendo en la DM2 recién diagnosticada del 17%,8 y entre pacientes con DM2 establecida que recibieron antidiabéticos orales, del 41.5% (Lanzer 2014).
A. La estructura de los vasos sanguíneos
La estructura de la pared de una arteria consiste en la disposición concéntrica de tres capas diferentes: la túnica íntima, la túnica media y la túnica adventicia (Figura 1).
La túnica íntima es la capa más interna y está compuesta por una primera capa de células epiteliales planas altamente especializadas que constituye el endotelio vascular en contacto con la sangre. Este descansa sobre una lámina basal, por debajo de la cual hay una fina capa de tejido conectivo laxo denominada capa subendotelial que puede no estar presente en los vasos de menor calibre. Entre la túnica íntima y la media se diferencia una capa limitante formada por fibras de elastina denominada lámina elástica interna. Esta capa confiere al vaso elasticidad y capacidad para extenderse y encogerse.
La túnica media es la capa intermedia y está formada por capas concéntricas de células musculares lisas entre las cuales se interponen capas organizadas de fibras elásticas, fibras colágenas y proteoglicanos.
Entre la túnica media y la adventicia se diferencia una capa limitante formada por elastina denominada lámina elástica externa.
15 La túnica adventicia es la capa externa y está compuesta por tejido conectivo laxo constituido por fibroblastos, fibras elásticas y fibras colágenas que se disponen paralelas al eje longitudinal del vaso sanguíneo. Por esta capa transcurren vasos de pequeño calibre, los vasa vasorum, que irrigan las células de los vasos (Sanchis 2008).
Figura 1: Ilustración de la estructura de los vasos sanguíneos.
Las arterias presentan una túnica media bastante más desarrollada que las venas mientras que en las venas la túnica adventicia es, frecuentemente, la capa más gruesa del vaso. Los capilares sólo presentan una túnica íntima formada por células endoteliales que se apoyan en su lámina basal (Tomada de Sanchis 2008).
B. Tipos de calcificación
Las calcificaciones vasculares las podemos clasificar dependiendo de dónde se deposite el calcio.
Según afecten a la íntima del vaso, como sucede en la aterosclerosis, o a la capa media. El tamaño del vaso también influye: la calcificación de la media o esclerosis de Mönckeberg, suele afectar a grandes arterias (aorta, ilíacas y coronarias), ligada a la rigidez vascular por mineralización de las fibras elásticas; las calcificaciones de arteriolas pueden dar lugar a la calcifilaxis o arteriolopatía urémica calcificante (Figura 2). En pacientes con ERC se observa una mezcla de ambos tipos de calcificación. De hecho, resultados recientes parecen sugerir que esta clasificación no sería tan clara y que ambos tipos de calcificación serían manifestaciones del proceso aterosclerótico (Fuery 2018).
16 Figura 2: Principales tipos de calcificación (Tomada de Fuery 2018)
i. Calcificación de la túnica íntima
La calcificación intimal aterosclerótica, es con mucho la forma más frecuente de vasculopatía calcificada, puede preceder a la osificación vascular a través de un proceso de osificación endocondral: 1) Inicialmente tiene lugar una combinación de necrosis celular, inflamación y deposición de colesterol, fosfolípidos y lipoproteínas (Boström 1993, Fuery 2017). Las placas ateroscleróticas están constituidas principalmente por una masa central grasa (ateroma) y una capa fibrosa (Karwowski 2012). La aterosclerosis es un proceso dinámico de la íntima arterial, durante el cual se establecen interacciones bidireccionales tanto con el endotelio y la sangre como
A. Calcificación arterial media (arterioesclerosis de Monckeberg) - se forman depósitos de calcio en la capa muscular media de la arteria (túnica media) - ocurren en las arterias periféricas musculares medianas y pequeñas, generalmente asintomáticas, pero asociadas a la rigidez de los vasos y al daño cardíaco y renal subsiguiente.
B. Ateroesclerosis de la íntima - proliferación del músculo liso de la íntima después de la acumulación y calcificación de la placa. Ocurre con mayor frecuencia en las arterias carótidas, los vasos coronarios y la aorta. El estrechamiento luminal produce una serie de presentaciones sintomáticas.
C. Calcificación arterial de la enfermedad renal crónica: combina las características de la calcificación arterial medial y la ateroesclerosis de la íntima: la enfermedad renal crónica predispone a la ateroesclerosis acelerada.
17 con las CVML. Las turbulencias del flujo sanguíneo en determinadas zonas de la circulación junto a fenómenos mecánicos debidos a la presión arterial condicionan la aparición de fenómenos adaptativos en la íntima, lo que explica que su grosor no sea uniforme y justifica la presencia de disfunciones locales en el revestimiento endotelial, que son la base del inicio del proceso de ateromatosis. La formación del ateroma comienza con una lesión o disfunción endotelial, que se produce por diversos factores, como hiperlipidemia, tabaquismo, hipertensión arterial, o envejecimiento, entre otros. Tras la lesión inicial sobreviene un proceso inflamatorio y de necrosis celular en el cual se produce la atracción, adhesión y migración de monocitos y linfocitos T a través del endotelio y reclutamiento de macrófagos que acumulan grandes cantidades de ésteres de colesterol, dando lugar a una estría grasa. Al mismo tiempo, las CVML migran hacia la íntima, engrosando considerablemente la pared arterial. Posteriormente se forma una capa fibrosa, que puede romperse o ulcerarse, exponiendo a la circulación los componentes de la masa central grasa y provocando la formación de un trombo que puede causar un accidente cardiovascular agudo. Seguidamente, la condrogénesis precede a la inducción osteoblástica y la formación de hueso. Ya en estadios tempranos las células musculares que migran hacia la intima empiezan a expresar proteínas características del hueso (Guerrero 2012). 2) Tras la acumulación a niveles subintimales de los oxilípidos y oxisteroles inflamatorios derivados del colesterol LDL y el peróxido de hidrógeno conducen a la calcificación interna aterosclerótica activando la diferenciación trans osteogénica BMP2 y Runx2/Cbfa1 de las CVML en condrocitos y osteoblastos. El reclutamiento de células vasculares calcificadas (CVC) proporciona una fuente adicional de osteoprogenitores.
Las CVML y las CVC producen vesículas de matriz mineralizante y cuerpos apoptóticos, que promueven una mayor mineralización. Como hemos comentado previamente, también, se ha demostrado que las arterias calcificadas y las células vasculares cultivadas expresan proteínas de la matriz ósea y factores reguladores que incluyen osteopontina, proteína Gla de la matriz, sialoproteína ósea, osteonectina, colágeno I y osteocalcina (Fuery 2017).
ii. Calcificación de la túnica media o de Mönckeberg
La calcificación en la túnica media fue descrita por primera vez en 1904 por J.G. Mönckeberg, quien la definió como un extenso acúmulo mineral en la túnica media que en ocasiones se extiende hasta la lámina elástica interna (Shanahan 1999 (a); Shanahan 2000). La calcificación vascular media comprende en los seres humanos una serie de enfermedades; en ausencia de conocimiento de la patogénesis molecular de diferentes tipos de calcificaciones vasculares medias, la nomenclatura propuesta se basa en la presencia o ausencia de factores de riesgo conocidos. La
18 esclerosis medial de Mockeberg representa la variedad más común de calcificación medial; con frecuencia se asocia con DM2 y enfermedad renal crónica; sin embargo, en algunos casos, ninguna de estas enfermedades ni otros factores de riesgo conocidos para las calcificaciones vasculares están presentes. En este último caso, es probable que existan factores de riesgo genéticos u otros que aún no se conocen (Figura 3) (Lanzer 2014).
Figura 3: Nomenclatura simplificada de las calcificaciones biológicas. (Tomada de Lanzer 2014).
En las primeras etapas, este tipo de calcificación presenta una morfología típica de depósitos lineales de fosfato cálcico en la túnica media, próximos a la lámina elástica. En lesiones avanzadas, los depósitos se disponen a lo largo de la media en forma de anillos, llegando a formar matriz ósea cuando la calcificación es muy extensa. Este tipo de calcificación es responsable del aumento de rigidez y con ello el descenso de la capacidad amortiguadora de los vasos, lo que provoca un aumento de la presión del pulso y favorece la hipertrofia del ventrículo izquierdo comprometiendo así la perfusión coronaria. Todos ellos son factores altamente asociados con la mortalidad (Lanzer 2014).
Las cuatro etapas de la progresión de la lesión distinguen la extensión y la gravedad del tipo de CV de CVm. En la etapa 1, aparecen calcificaciones en la tinción de hematoxilina-eosina (H & E) como depósitos irregulares de color azul o violeta incrustados en la media. Ambos depósitos intra y extracelulares están presentes. Los depósitos intracelulares se localizan en las CVML; los
19 depósitos extracelulares se asocian en gran medida con fibras elásticas dañadas y fracturadas incrustadas dentro de la matriz extracelular. En las arterias musculares y de transición, con tinción con H & E se desarrollan calcificaciones granulares junto con la membrana elástica interna (MEI) y CVML cercanas. La participación de la MEI es común. Estas bandas de depósitos ricos en calcio pueden espesarse, convirtiéndose en placas sólidas que se extienden profundamente en la capa interna de la media. Con una mayor progresión de la enfermedad, las calcificaciones pueden distorsionar las uniones de las capas más internas y más externas de la media, abarcando hasta tres cuadrantes de la sección transversal (etapa 2) o puede implicar toda la circunferencia (etapa 3). En las etapas 2 y 3, grandes conglomerados de calcificaciones pueden formar placas sólidas o vainas, distorsionando progresivamente la arquitectura de la media; las intrusiones sobre la íntima son entonces comunes. En ausencia de lesiones ateroscleróticas, la íntima muestra una hiperplasia subendotelial. La Figura 4, demuestra las características de las etapas 1-3 en la muestra histológica. En la etapa 4 de CVm se pueden encontrar focos de formación ósea dentro de la arterial media, las calcificaciones pueden sufrir metaplasia ósea dando lugar a verdaderas trabéculas óseas. Estas estructuras delinean verdaderos espacios medulares que albergan células hematopoyéticas intercaladas con adipocitos (Lanzer 2014).
Figura 4: Imágenes microscópicas de calcificación de la túnica media.
Pequeñas calcificaciones (flecha) junto con la membrana elástica interna (asterisco) característica de la esclerosis media de Mönckeberg (frotis femoral, microscopía de fluorescencia, 400 ×) (A). Amplitudes máximas de calcificaciones calcáreas (flecha) en las proximidades de las células del músculo liso vascular
20 (asterisco) se demuestra en la lesión de esclerosis media de Mönckeberg en estadio 1 (arteria femoral, hemoxina-eosina, 200 ×) (B). Se observan calcificaciones que se vuelven contiguas y se forman placas sólidas (flechas) y hiperplasia subendotelial (asteriscos) en la íntima; los hallazgos corresponden a la etapa 2 de la esclerosis media de Mönkeberg (arteria femoral, tinción de hematoxilina-eosina, 40 ×) (C). La etapa 3 de la esclerosis media de Mönckeberg se caracteriza por calcificaciones que distorsionan la media que abarcan toda la circunferencia (flechas) (arteria tibial anterior, tinción de hematoxilina-eosina, 40 ×) (D) (Tomada de Lanzer 2014).
En la pared arterial, los depósitos de calcificación asociados con CVm pueden percibirse como cuerpos extraños e inducir la formación de granulomas dentro de la media; estas estructuras a menudo contienen células gigantes multinucleadas. También pueden estar presentes otros componentes inflamatorios tales como células espumosas, linfocitos y mastocitos. En etapas avanzadas, las calcificaciones grandes pueden inducir cambios secundarios en la íntima, como la hiperplasia subendotelial caracterizada por un aumento de la celularidad (por ejemplo, miofibroblastos, fibroblastos, fibrocitos) y ulceraciones caracterizadas por infiltraciones de la íntima o incluso protuberancias en la luz. Debe tenerse en cuenta que las lesiones de CVm no remiten espontáneamente y las complicaciones clínicas pueden variar según el sitio y la cantidad de calcificación. La CV de las lesiones de la media pueden convertirse en sitios de trombosis o pueden desprenderse y causar embolia periférica. Aunque las CVm no son necesariamente indicativas de enfermedad arterial periférica (PAD), la coincidencia es común. Anatómicamente, las lesiones de CVm también pueden involucrar la microcirculación, por ejemplo, arteriolas (10-500 µm de diámetro). Sin embargo, no se han realizado estudios sistemáticos sobre la extensión de las lesiones de CVm hacia la microcirculación. En CVm, las arterias afectadas muestran calcificaciones lineales de la media y MEI. Si bien las calcificaciones están presentes en todas las lesiones de CVm, no representan un hallazgo consistente en el ateroma (estadios Stary IV-VII) (Stary 2000).
Dentro de la CVm se incluye también la calcifilaxis o arteriolopatía urémica calcificante (CUA), un síndrome caracterizado por lesiones cutáneas dolorosas, nódulos subcutáneos, isquemia tisular y necrosis de la piel y del tejido subcutáneo de las manos y los pies. Dichas lesiones se producen por la calcificación de las arteriolas dermoepidérmicas de los miembros distales. Esta alteración vascular periférica es una rara complicación de la ERC y se presenta aproximadamente en el 1%
de los pacientes en diálisis. El diagnóstico de este padecimiento empeora considerablemente el pronóstico de los pacientes (Lanzer 2014).
21 La Tabla 1, resume las variantes histoanatómicas de la CV, características de cada una de ellas y enfermedades asociadas.
Tabla 1: Calcificación Vascular. Visión histoanatómica (Tomada de Karwowski 2012).
3.1.1. Calcificación vascular y enfermedades relacionadas
La CV, como hemos dicho previamente es un proceso biológico regulado activamente y asociado con la cristalización de hidroxiapatita en la matriz extracelular, en la túnica media (CVm) o íntima (CVi) de la pared arterial. Ambos patrones de CV a menudo coinciden, y se asocian a mayor edad, sexo masculino, larga duración de la diálisis, diabetes, hipertensión, consumo de tabaco, consumo de alcohol, hiperfosfatemia, hipercalcemia, hiperparatiroidismo, uso de altas dosis de vitamina D, inflamación e hipoalbuminemia representan factores de riesgo conocidos para el desarrollo de CV en pacientes. Figura 3 (Lanzer 2014, Rennenberg 2009).
expression of ALP. The influence of omega-3 acid primar- ily results from the activation of mitogen-activated protein kinase (MAPK kinase) or peroxisome proliferator-activated receptor-alpha (PPAR-gamma) pathways [41]. HDL also re- duces ALP expression and prevents calcification induction via its influence on Il-1, Il-6, and oxLDL [42].
Under in vitro conditions, the calcifying vascular cells (CVCs) (a subpopulationof smooth muscle cells with osteoblastic characteristics that spontaneously form bone mineral) pres- ent in atherosclerotic plaques may spontaneously produce mineral that clusters locally as small lumps, histologically resembling atherosclerotic plaque or lesions originating on heart valve cusps [1]. Area density of calcification foci de- pends on the presence of stimulators and inhibitors of cal- cium accumulation (Table 2). Increased concentration of transforming growth factor beta (TGF-b), vitamin D3 (Vit.
D3) or warfarin – a popular MGP inhibitor – increases the number and size of calcification foci [43,44].
(1a’) Cardiac valve calcification
Dystrophic calcification most often affects the aortic valve, as a result of long-standing action of mechanical stress and pro- inflammatory factors. It has been proven that the connective
tissue of calcified aortal valve stroma demonstrate disturbed organization of elastin, lipid depositions, chronic inflamma- tion, fibrosis, stippled calcium deposits, macrophage and T-lymphocyte infiltration [45,46]. Similar changes in aortal valve stroma were observed in persons who did not exhib- it evident features of atherosclerosis [46], which may be a proof that early stages of calcification of valve cusps involve different mechanisms and may anticipate atherosclerosis de- velopment in coronary vessels. During the progression of changes, cellular and molecular analysis of valves revealed osteoblastogenesis, the presence of CVCs, presence of chron- ic inflammation markers, increased expression of osteo- pontin, BMP, and mature bone tissue in as much as 10% of the samples [47–49]. The substantial contribution of dys- lipidemia in heart valve calcification pathogenesis has been proven, thus establishing the favorable influence of atorv- astatin [50] and eplerenone (aldosterone receptor inhibi- tor) on valvular change progression [51]. It has been shown that treatment with 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitors increased the protein expression and functional activity of endothelial nitric ox- ide synthase (eNOS), improved C-reactive protein (CRP) concentrations, increased nitrite concentrations, and de- creased calcification in aortic valves. These changes coin- cided with inhibition of calcification in the aortic valve and
Histoanatomic variant Selected characteristics Disease example/association
Atherosclerotic calcification Cellular necrosis and debris Evolution of fibro-fatty plaque
Calcium deposition with lipoproteins, cellular lipid debris Macrophages, T cells, endothelial dysfunction, platelet and myofibroblast activation
Cartilage metaplasia/calcified cartilage, endochondrial bone formation
Marrow formation with hematopoiesis visualized in advanced disease
Atherosclerosis Hypercholesterolemia Hypertension Inflammation Osteoporosis
Similar histology in calcifying fibrotic myocardial infarct
Cardiac valve calcification Interstitial cell activation/inflammation
T cells, macrophages, interstitial adipocytes, and myofibroblasts Dystrophic calcium deposition
Osteogenesis, intramembranous (nonendochondrial) bone formation
Rare cartilage metaplasia/calcified cartilage, infrequent endochondrial bone formation
Marrow formation with hematopoiesis visualized in advanced disease
Senile calcific aortic sclerosis Bicuspid aortic valve calcification Bioprosthetic valve calcification Hyperlipidemia
Congenital bicuspid valve Rheumatic heart disease
Medial artery calcification (Mönckeberg’s medial calcific sclerosis)
Adventitial activation/inflammation
Macrophages, T cells, myofibroblasts, adipocytes, medial VSMCs and CVCs
Matrix vesicles, with osteogenesis resembling intramembranous (nonendochondrial) bone formation
No cartilage formation
Type 1 diabetes Type 2 diabetes End-stage renal disease Hyperphosphatemia
Vascular calciphylaxis Amorphous calcium phosphate deposition with widespread organ and soft tissue involvement
Serum calcium-phosphorus product >60 mg/dl No osteogenesis
No chondrogenesis
End-stage renal disease
Acute renal insufficiency with muscle injury Tumor lysis
Iatrogenic hiperphosphatemia Warfarin overdose
Table 1. Macrovascular calcification: a histoanatomic view.
VSMCs – vascular smooth muscle cells; CVCs – calcifying vascular cells (adapted from Vattikuti R, Towler DA: Osteogenic regulation of vascular calcification: an early perspective. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2004; 286: E686–96).
Review Article Med Sci Monit, 2012: 18(1): RA1-11
RA4
22 Asimismo en un metanálisis se concluyó que la presencia de calcificación en cualquier pared arterial está asociada con un riesgo 3-4 veces mayor de mortalidad, eventos cardiovasculares (Rennenberg 2009), enfermedad arterial e insuficiencia cardíaca (Sanchis 2016). Es importante darse cuenta de que los sujetos con calcificación vascular son pacientes de alto riesgo.
3.1.2. Calcificación vascular y diabetes mellitus
La prevalencia de CV en pacientes con DM2 es más pronunciada que en las personas con DM1, y se considera la calcificación de la túnica media como un fuerte predictor independiente de mortalidad cardiovascular en pacientes con DM2 (Niskanen 1994). Aunque se desconoce cuál es la causa real parece ser que otros trastornos metabólicos que acompañan a la DM2 pueden actuar como promotores del proceso de calcificación. La CV en pacientes con diabetes es progresiva y se acelera en pacientes con un mal control glucémico, con aumento de resistencia a la insulina y en los que presentan insuficiencia renal crónica (Budoff 2005; Mehrotra 2005; Snell-Bergeon 2003;
Dabalea 2003). Sin embargo, los pacientes con DM2 que están libres de nefropatía diabética también presentan una elevada CV (Merjanian 2003; Koba 2004). Siendo la prevalencia de la CVm más frecuente en hombres que en mujeres (London 2003).
Existe una relación establecida entre la hiperglucemia, la calcificación arterial coronaria (CAC) y la hemoglobina glicosilada (HbA1c) como predictor de enfermedad cardiovascular. De hecho, la evidencia epidemiológica apoya un mayor riesgo de enfermedad vascular coronaria aterosclerótica con un aumento de la disglucemia, un aumento estimado de 11 a 16% en los eventos cardiovasculares por cada 1% de aumento en la HbA1c (Yahagi 2017). Otros autores también mostraron que la enfermedad valvular aórtica diabética está acompañada por un mayor grado de calcificación, mientras que la inflamación en el estudio de Mosch y cols. fue similar en individuos diabéticos y no diabéticos. Los pacientes diabéticos mostraron signos inflamatorios menores o iguales y una calcificación más temprana. Del mismo modo, los niveles de glucosa parecen jugar un papel en la severidad de la calcificación en pacientes diabéticos con HbA 1c más alta (> 6,5%), los cuales muestran una tendencia hacia una mayor macrocalcificación detectada por la tinción con rojo de alizarina (Mosch 2017).
Otros estudios han demostrado que la inflamación de bajo grado juega un papel crucial en la patogenia común de la resistencia a la insulina y de la disfunción endotelial con el consecuente
