revisión corta
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1. ESTUDIO TRANSVERSAL PARA EVALUAR LA RELACIÓN ENTRE LOS NIVELES DE LOS PRODUCTOS FINALES DE GLICACIÓN AVANZADA,
BIOMARCADORES ÓSEOS E INFLAMATORIOS Y LA CALCIFICACIÓN ABDOMINAL AÓRTICA EN PACIENTES CON DIABETES MELLITUS TIPO 2
5.1.1. Diseño del estudio y pacientes
La muestra del estudio consistió en 104 pacientes con DM2 con más de 5 años de evolución, que se habían realizado una radiografía de columna lumbar en los últimos 6 meses. Todos eran pacientes mayores de 40 años, ambulatorios que se reclutaron consecutivamente en la consulta de Endocrinología del Hospital Son Llatzer (Palma de Mallorca, España).
Como criterios de exclusión se consideraron cualquier condición médica que limite la supervivencia del paciente menos de 1 año; inmunodeficiencia o infección por el VIH; abuso de tóxicos o alcoholismo crónico o ingesta total diaria de alcohol >50 g/d; índice de masa corporal [IMC] > 40 kg/m2; que estén participando o hayan participado en ensayos clínicos farmacológicos o toma de cualquier fármaco en investigación en el último año; pacientes ingresados en instituciones por alguna enfermedad crónica, sin autonomía, incapaces de andar sin dirección postal fija o con imposibilidad de acudir a las visitas programadas; analfabetismo; los pacientes con una infección o inflamación aguda [i.e., neumonía] en los últimos 3 meses; neoplasia activa;
pacientes con antecedentes de tumor maligno en remisión desde hace menos de un año o presencia de metástasis óseas; vasculitis activa; HTA severa refractaria; insuficiencia hepática moderada o grave; enfermedad renal crónica estadio 4 o superior (FG < 30 ml/min/1,73 m2).
Se registraron en el cuaderno de registro de datos (CRD) las variables correspondientes de la historia clínica. (Anexo I)
Se midió el grado de calcificación aórtica abdominal por radiografía de columna lumbar lateral y se recogieron las variables demográficas como la edad, el sexo, el índice de masa corporal (IMC), historia de tabaquismo y enolismo. La talla y el peso fueron medidos con el sujeto sin zapatos y con ropa ligera, en una báscula seca con escala: rango de 0,05 a 150Kg; precisión de 0,05Kg;
calibrada. El IMC se calculó dividiendo el peso del sujeto en kilogramos por la talla en metros cuadrados y se registraron el día de la visita de reclutamiento.
79 Se registraron datos de la presión arterial sistólica [mmHg] (la del día de la primera visita), presión arterial diastólica [mmHg] (la del día de la primera visita), presión de pulso (PA sistólica-presión PA diastólica) [mmHg] y frecuencia cardiaca [latidos por minuto] (la de la primera visita). La presión arterial se midió tres veces, en el brazo dominante, después de 5 minutos de descanso, mientras el participante estaba sentado en silencio. Se registró el promedio de la segunda y tercera medida.
Los pacientes que utilizaron medicamentos antihipertensivos y aquellos con presión arterial sistólica ≥140 mmHg y / o presión arterial diastólica ≥90 mmHg se clasificaron como hipertensos (Chobanian 2003).
También se registró el historial personal de enfermedades vasculares cardiopatía isquémica (infarto de miocardio, angina crónica, angina inestable, revascularización coronaria mediante cirugía o percutánea); insuficiencia cardiaca congestiva (con necesidad de ingresos por descompensaciones); enfermedad cerebrovascular (accidente cerebrovascular y accidente isquémico transitorio); enfermedad vascular periférica (claudicación intermitente, aneurisma aorta abdominal, angioplastia o cirugía vascular o amputaciones).
Se registró la historia personal de osteoporosis. Además se revisó el tratamiento habitual de los pacientes que cumplieron criterios de inclusión en el estudio.
5.1.2. Mediciones de laboratorio 5.1.2.1. Muestras de sangre y orina
Todas las determinaciones analíticas fueron extraídas tras un mínimo de 8 horas de ayuno nocturno. Para la determinación de cociente albúmina – creatinina en orina y microalbuminuria se recogió la primera orina de la mañana el mismo día de la extracción analítica y se centrifugó a 2500 rpm durante 5 minutos. Las muestras permanecieron durante 30 minutos a temperatura ambiente y el suero fue separado posteriormente mediante centrifugación a 3500 rpm durante 15 minutos. Todas las muestras se analizaron por duplicado, siendo la variación del coeficiente intra e interensayo inferior a 10%.
Los parámetros hematológicos y bioquímicos fueron procesados en analizadores automáticos (Cell-Dyn Sapphire y Architect cil6200, Abbott). La proteína C reactiva ultransensible (hsCRP) y la
80 microalbuminuria fueron analizados mediante inmunoturbidimetría (Architect, Abbott). La HbA1c se analizó mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, Menarini/Arkray Adams HA-8180V). El LDL – colesterol fue calculado mediante la fórmula de Friedewald para triglicéridos
<300 mg/dl. Los niveles de iPTH fueron medidos utilizando inmunoanálisis tipo sándwich de dos pasos que utiliza la tecnología CMIA (Architect Abbott). Se analizaron además, la vitamina D-OH25 mediante inmunoanálisis quimio luminiscente de micropartículas (CMIA) (Architect Abbott), fosfato mediante espectrofotometría UV (Architect Abbott), fosfatasa alcalina usando P-nitrofenil fosfato (Architect Abbott) y albúmina usando verde de bromocresol (Architect Abbott).
5.1.2.2. Determinación de los AGEs
Las muestras de sangre se recogieron en tubos que contenían EDTA (Becton Dickinson) y el plasma se aisló mediante centrifugación a 3500 rpm durante 15 minutos. Las muestras de plasma se almacenaron a -80 ° C antes de ser analizadas.
Los AGEs en muestras de suero se midieron utilizando el kit competitivo ELISA OxiSelect™ de Cell Biolabs, que proporciona una detección rápida y cuantificación de los AGEs circulantes. La cuantificación se determinó utilizando una curva estándar AGE-BSA.
Dividimos nuestra muestra en tres grupos según el tercil de AGEs: niveles bajos (B: <6,5 U/mL), intermedios (I: 6,5 – 10,4U/mL) y altos (A > 10,4U/mL) de AGEs circulantes.
5.1.2.3. Determinación de biomarcadores
Las muestras de sangre tuvieron el mismo tratamiento comentado en el punto 5.1.2.2.
Posteriormente en la plataforma de proteómica del IdisBa, en el plasma, mediante kits comerciales ELISA Y LUMINEX, se determinaron:
- Interleucina (IL-6) (pg/ml), adiponectina (pg/ml), y TNF- α (pg/ml) como marcadores de inflamación.
- BMP-2 (pg/ml) y osteoprotegerina (pg/ml) como marcadores del metabolismo óseo.
81 Todas las muestras se analizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron por duplicado por personal ciego al grupo de cada paciente. No se esperaban interferencias ni reactividad cruzada según las instrucciones del fabricante.
Para analizar los niveles de los biomarcadores, adiponectina, BMP-2, IL-6, osteoprotegerina, TNF- α, en el suero de los pacientes, utilizamos una premezcla humana. [Kit de múltiples analitos (LXSAHM-10, R&D Systems)]. Básicamente, los sueros y los estándares se diluyeron con Calibrator Diluent RD6-52, el cóctel de micropartículas y el de anticuerpos de biotina, se diluyeron con el Diluent RD2-1; la estreptavidina-PE se diluyó con un tampón de lavado para proteger estos reactivos de la luz en todo momento siguiendo las instrucciones del kit. Se agregaron 50 uL del cóctel de micropartículas a cada pocillo de la microplaca, luego se agregaron 50 µL/pocillo del estándar o muestra a cada pocillo y se incubaron durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. La placa se colocó en un dispositivo magnético durante al menos 1 minuto y se lavó tres veces. Se agregaron 50 uL del cóctel de anticuerpos de biotina diluido a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de 3 lavados más, se agregaron 50 uL de estreptavidina-PE diluida a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos, y se lavaron nuevamente con la placa sobre el dispositivo magnético. Las micropartículas fueron resuspendidas en 100 uL/pocillo de tampón de lavado y se leyeron utilizando un sistema MAGPIX® (Luminex).
Los resultados se analizaron utilizando el software Milliplex Analyst (Merck Millipore).
5.1.3. Placa de columna lumbar lateral
La radiografía lateral de columna lumbar se realizó utilizando un mismo equipo radiológico estándar para todos los pacientes en posición de pie con un mínimo de 8cm por delante de las espinas lumbares. Los segmentos evaluados de la radiografía fueron L1 y L4 (Figura 22). Mientras que el sistema de puntuación se ha representado esquemáticamente en las Tablas 4 y 5.
La calcificación de la aorta abdominal se calificó mediante un sistema validado previamente (Kauppila 1997). Los resultados se resumieron utilizando dos métodos: (a) la puntuación compuesta para la severidad anterior-posterior (asignado aquí como CAA), donde se suman las puntuaciones individuales de los segmentos de la pared anterior y posterior (puntuación máxima 24); (b) puntuación de segmentos afectados, donde se anotarán como el número total de segmentos aórticos que muestran algún nivel de calcificación (puntuación máxima 4).
82 La puntuación fue calculada por dos radiólogos independientes que desconocían las características de los pacientes, y cuando hubo discrepancia se llegó a una puntuación de consenso.
Figura 22. Esquema de la columna lumbar.
Tabla 4. Graduación de la calcificación aórtica abdominal.
Graduación 0 Sin depósitos de calcificación en la vértebra.
1 Depósitos pequeños dispersos de calcificación siendo menos de 1/3 de la longitud de la pared de la aorta.
2 De 1/3 a 2/3 de la pared calcificada.
3 2/3 o más de la pared calcificada.
83 Tabla 5. Sistema de puntuación total de la CAA. La calcificación se estimó considerando las paredes anterior y posterior de la aorta abdominal adyacente a las vértebras L1-L4.
Segmento
Afectado Nivel Puntuación del segmento Puntuación total (CAA) Pared posterior
(Rango 0-3) Pared anterior (Rango 0-3)
Gravedad Anterior Posterior (Rango 0-6)
L1 1 1 0 1
L2 1 2 1 3
L3 1 3 2 5
L4 1 3 3 6
TOTAL 4 9 6 15
MÁXIMO 4 12 12 24
La gradación de la calcificación abdominal aórtica se clasificó:
- En el estudio para determinar la relación de los niveles de AGEs y la CAA, se establecieron dos grupos según la mediana de CAA: no calcificación o leve (CAA<6) y calcificación moderada ó severa (CAA>=6).
- En el estudio para determinar la relación entre biomarcadores óseos e inflamatorios y la CAA, se establecieron tres grupos: pacientes con no calcificación o calcificación leve, calcificación moderada y calcificación severa. La puntuación según el grado de calcificación fue: No CAA o leve: < 3, CAA moderada: 3-11, CAA severa: >=12.
5.1.4. Análisis estadístico
Se utilizaron tests y gráficos de normalidad para determinar si las variables siguen una distribución normal. Las variables de distribución normal se expresaron como media ± desviación estándar y las que no tienen distribución normal se expresaron como mediana y rango intercuartílico.
Se utilizaron las pruebas ANOVA y t-student o Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney para las variables cuantitativas; y el test chi-cuadrado para las variables cualitativas. Las correlaciones se examinaron por la correlación de rangos de Spearman o Pearson. Se utilizó la regresión binaria logística (univariante y multivariante) para estudiar los factores independientes asociados a la calcificación moderada - severa (vs. No ó Leve). El análisis estadístico se realizó usando el programa SPSS versión 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Se consideró indicador de una diferencia significativa un valor de p inferior a 0,05.
84 Además, las curvas ROC y la regresión binaria logística (cruda y ajustada) se utilizaron para estudiar la relación de biomarcadores óseos e inflamatorios y la calcificación moderada o severa (vs. no o leve) Se consideró indicador de una diferencia significativa un valor de p < 0,05.
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