Overgangen mellom 4.trinn og 5.trinn

Dada a importância das IBDs e sua crescente incidência a cada ano, é necessário desenvolver e otimizar protocolos que sirvam como ferramentas para estudar a doença em modelo animal, de modo que permita a descoberta de novos medicamentos e estratégias para uma terapia alternativa mais eficaz, mais barata e, principalmente, com poucos efeitos colaterais.

Foram necessários 3 experimentos em modelo animal para que a técnica fosse padronizada. Cada experimento permitiu a otimização de doses de L. lactis recombinantes; o tempo necessário de tratamento; o tempo do agente químico a ser administrado e sua concentração; a idade e o peso adequados dos camundongos para iniciar os experimentos; e a determinação dos critérios bioquímicos, fisiológicos e imunológicos a serem testados, até que no último experimento, já com todos estes parâmetros otimizados, foram analisados os efeitos anti-inflamatórios locais e sistêmicos induzidos pelo esquema de tratamento testado e padronizado.

4.8.3.1 Experimento Animal 1

O primeiro experimento, que teve a duração de 14 dias, pode ser considerado como um experimento piloto. Esse experimento foi composto por 6 grupos com o total de 42 animais os quais tinham 7 semanas de idade e pesavam entre 14 e 20 gramas. A dose administrada de bactéria foi de 5 x 108 _{UFC/dia. Dos dias 1 ao 7 foi induzida a} colite com DSS 2% e dos dias 8 ao 14 foi administrado o DSS 2% concomitantemente com bactéria.

Material e Métodos

Para facilitar a compreensão de cada experimento animal, será exibida uma tabela com o esquema de tratamento associada com uma linha do tempo do respectivo esquema de tratamento.

A tabela 10 e a figura 8 listam o esquema de tratamento do experimento animal 1.

Tabela 10. Esquema de tratamento do experimento animal 1.

Grupo (n° de animais) Dias 1 a 7 Dias 8 a 14 Dia 15

CN (6) Salina 0,9% Salina 0,9% Eutanásia DSS (6) DSS 2% DSS 2% LL-F (7) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FT (8) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FI (7) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FTI (8) DSS 2% DSS 2% + Bactéria

Grupos experimentais: CN, grupo controle negativo da colite; DSS, grupo controle positivo da colite; F, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+; FT, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF); FI, grupo L.

lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-IL1b) e FTI, grupo com associação de L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF) e L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-IL1b).

Figura 8. Linha do tempo do experimento animal 1. O experimento 1 foi composto por 42 animais,

dos quais os do grupo CN ingeriram somente salina e água filtrada durante todo o experimento. Os grupos DSS, LL-F, LL-FT, LL-FI e LL-FTI ingeriram DSS 2% adicionado à água filtrada durante todo o experimento. Dos dias 8 ao 14, os grupos LL-F, LL-FT, LL-FI e LL-FTI receberam L. lactis recombinantes. Os animais foram sacrificados no dia 15 (seta).

Dias 1 7 14 15

Material e Métodos

4.8.3.2 Experimento Animal 2

O experimento animal 2 foi realizado com 2 esquemas distintos de tratamento divididos em 2A e 2B.

O esquema 2A foi composto por 21 animais divididos em 5 grupos, conforme a tabela 11 e a figura 9. Dos dias 1 ao 4 foi administrado DSS 2% seguidos por administração de DSS 2% e bactéria por mais 4 dias, totalizando 8 dias de experimento. Os animais tinham 10 semanas de idade e o peso inicial variou de 18 a 23 gramas. A dose de bactéria administrada foi de 5 x 109 _UFC/dia.

Tabela 11. Esquema de tratamento do experimento animal 2A.

Grupo (n° de animais) Dias 1 a 4 Dias 5 a 8 Dia 9

CN (3) Salina 0,9% Salina 0,9% Eutanásia DSS (3) DSS 2% DSS 2% LL-F (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FT (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FI (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria

Grupos experimentais: CN, grupo controle negativo da colite; DSS, grupo controle positivo da colite; F, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+; FT, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF) e FI, grupo

Material e Métodos

Figura 9.Linha do tempo do experimento animal 2A. O experimento 2A foi composto por 21 animais,

dos quais os do grupo CN ingeriram somente salina e água filtrada durante todo o experimento. Os grupos DSS, LL-F, LL-FT e LL-FI ingeriram DSS 2% adicionado à água filtrada durante todo o experimento. Dos dias 5 ao 8, os grupos LL-F, LL-FT e LL-FI receberam L. lactis recombinantes. Os animais foram sacrificados no dia 9 (seta).

Já o esquema de tratamento 2B (Tabela 12 e figura 10), que também foi composto por 21 animais divididos em 5 grupos, durou 12 dias divididos em 3 fases: administração de DSS 2% dos dias 1 ao 4, administração de DSS 2% e bactéria nos dias 5 ao 8, e do 9° dia em diante foi interrompido o DSS 2% e administrada somente bactéria até o 12° dia. Os animais tinham 10 semanas de idade e o peso inicial variou de 18 a 23 gramas. A dose de bactéria administrada foi de 5 x 109 _UFC/dia.

Tabela 12. Esquema de tratamento do experimento animal 2B.

Grupo (n° de animais) Dias 1 a 4 Dias 5 a 8 Dias 9 a 12 Dia 13

CN (3) Salina 0,9% Salina 0,9% Salina 0,9%

Eutanásia

DSS (3) DSS 2% DSS 2% DSS 2%

LL-F (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria Bactéria

LL-FT (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria Bactéria

LL-FI (5) DSS 2% DSS 2% + Bactéria Bactéria

Grupos experimentais: CN, grupo controle negativo da colite; DSS, grupo controle positivo da colite; F, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+; FT, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF) e FI, grupo

L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-IL1b).

Dias 1 4 8 9 DSS 2% DSS 2% + L. lactis

Material e Métodos

Figura 10. Linha do tempo do experimento animal 2B. O experimento 2B foi composto por 21

animais, dos quais os do grupo CN ingeriram somente salina e água filtrada durante todo o experimento. O grupo DSS ingeriu a substância química durante todo o experimento. Os grupos LL-F, LL-FT e LL-FI ingeriram DSS 2% dos dias 1 ao 8, e dos dias 5 ao 12 estes grupos receberam L. lactis recombinantes. Os animais foram sacrificados no dia 13 (seta).

4.8.3.3 Experimento Animal 3

Com base nos 2 experimentos com modelo animal realizados e seus respectivos resultados, chegamos a um desenho experimental bem delineado, que foi testado no experimento 3. Este experimento foi composto por 7 grupos com o total de 41 animais com 10 semanas de idade. O peso inicial dos animais variou de 15 a 20 gramas. A dose administrada de bactéria foi de 2,5 x 109 _{UFC/dia. Dos dias 1 ao 4 foi induzida a} colite com DSS 2% e dos dias 5 ao 8 foi administrado DSS 2% concomitantemente com bactéria. A tabela e a figura a seguir listam o esquema de tratamento do experimento animal 3 (Tabela 13 e figura 11).

Tabela 13. Esquema de tratamento do experimento animal 3.

Grupo (n° de animais) Dias 1 a 4 Dias 5 a 8 Dia 9

CN (4) Salina 0,9% Salina 0,9% Eutanásia DSS (6) DSS 2% DSS 2% LL-M (4) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-F (6) DSS 2% DSS 2% + Bactéria LL-FT (7) DSS 2% DSS 2% + Bactéria Dias 1 4 8 12 13 DSS 2% DSS 2% + L. lactis L. lactis

Material e Métodos

LL-FI (7) DSS 2% DSS 2% + Bactéria

LL-FTI (7) DSS 2% DSS 2% + Bactéria

Grupos experimentais: CN, grupo controle negativo da colite; DSS, grupo controle positivo da colite; M, grupo L. lactis MG1363; F, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+; FT, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF); FI, grupo L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-IL1b) e FTI, grupo com associação de L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-TNF) e L. lactis MG1363 FnBPA+ (pValac::anti-IL1b).

Figura 11. Linha do tempo do experimento animal 3. O experimento 3 foi composto por 41 animais,

dos quais os do grupo CN ingeriram somente salina e água filtrada durante todo o experimento. Os grupos DSS, LL-M, LL-F, LL-FT, LL-FI e LL-FTI ingeriram DSS 2% adicionado à água filtrada durante todo o experimento. Dos dias 5 ao 8, os grupos LL-M, LL-F, LL-FT, LL-FI e LL-FTI receberam L. lactis. Os animais foram sacrificados no dia 9 (seta).