Ordinary science observations

Para determinação de sulfato foi utilizado o kit Accuvac Sulfaver da HACH Company, cujo limite de detecção é de 0,5 mg/L e o máximo de 7 mg/L.

A2 Análises Microbiológicas

As análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Microbiologia Ambiental, Departamento de Biologia da Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba.

A2.1 Microscopia de contraste de fase e fluorescência UV

Os exames de microscopia foram realizados com microscópio Leica DMLB, com sistema de captura de imagem Optronics e software Image Pro-Plus.

A2.2 Determinação de coliformes

A determinação de coliformes se dá a partir das características que o grupo apresenta, pois estes microrganismos são bactérias em forma de bacilos, gram-negativas e fermentadoras de ácidos e lactose resultando na produção de gases, característica esta que permite a detecção do grupo por meio do teste de tubos múltiplos. Para quantificar estas bactérias foi necessário realizar três testes: Presuntivo, Confirmativo e Completo.

Para o teste Presuntivo houve a realização de diluições decimais da amostra. O meio utilizado foi o caldo lactosado (Acumedia) (Tabela A1), com incubação a 35ºC por 48 horas, sendo que os tubos que turvaram e apresentaram formação de gases, dentro do tubo Durhan invertido, foram considerados positivos, indicando presença de coliformes.

Tabela A1: Composição do caldo Lactosado

Reagentes Concentração (g/L) Triptose 20,0 Lactose 5,0 K2HPO4 2,75 KH2PO4 2,75 Cloreto de sódio 5,0 Lauril-sulfato de sódio Púrpura de bromocresol 0,1 0,01 pH = 7,0

Sendo assim, uma alíquota de cada tubo positivo foi transferida para novos tubos de ensaio, alguns contendo meio Verde Brilhante (Himedia) (Tabela A2), e outros contendo meio EC (Acumedia) (Tabela A3).

Tabela A2: Composição do caldo Lactosado Verde Brilhante

Reagentes Concentração (g/L)

Peptona 10,0

Lactose 10,0

Bile de boi desidratada 20,0

Verde Brilhante 0,0133

pH = 7,0

Tabela A3: Composição do meio E. C.

Reagentes Concentração (g/L) Triptose 20,0 Lactose 5,0 K2HPO4 4,0 KH2PO4 1,5 Cloreto de sódio 5,0 pH = 6,9

Para confirmar a presença dos coliformes foi utilizado tubos de ensaio contendo o meio Verde Brilhante, responsável pelo teste Confirmativo, os quais foram incubados a 35ºC pelo período de 48 horas. Já para determinar a presença de Escherichia coli foi utilizado o meio EC, responsável pelo teste Completo, onde os tubos foram incubados em banho maria à 44,5ºC também pelo período de 48 horas. Os resultados foram verificados a partir da formação de gases nos tubos Durhan invertidos, decorrentes da fermentação da lactose (Figura A1). Para todos os testes realizados usou-se uma tabela do número mais provável (NMP/100mL) para quantificar as bactérias (APHA, 2005).

Figura A1: Imagem do tubo de ensaio contendo o meio EC, confirmando a presença de Escherichia coli devido à formação de gases

A2.3 Determinação de Bactérias Desnitrificantes

Para quantificar-se as bactérias desnitrificantes utilizou-se a técnica dos tubos múltiplos descrita conforme a metodologia de Tiedje (1982) tanto para as amostras de lodo da lagoa de São Carlos como para o lixiviado. Os resultados foram apresentados em função do Número Mais Provável (NMP) (APHA, 2005).

Inicialmente, preparou-se a água de diluição (Tabela A6) utilizando-se as soluções estoques de fosfato de potássio (Tabelas A4 e A5) as quais foram esterilizadas previamente em autoclave e armazenadas sob refrigeração em frascos âmbar.

Tabela A4 : Solução Estoque 1

Reagente Quantidade – q.s.p. 100mL de água ultrapurifica

K2HPO4 (0,2M) 3,48g

Tabela A5: Solução Estoque 2

Reagente Quantidade – q.s.p. 100mL de água ultrapurifica

KH2PO4 (0,2M) 2,72g

Tabela A6: Água de Diluição

Água de Diluição Quantidade – q.s.p. 100mL de água ultrapurifica

Solução Estoque 1 1,0 Ml

O meio utilizado para a inoculação foi o caldo nutriente (Tabela A7), acrescido de nitrato de potássio em uma concentração de 500 mg/L.

Tabela A7: Composição do meio Caldo Nutriente

Reagentes Concentração (g/L) Peptonas Cloreto de Sódio Extrato de carne Extrato de Levedura 5,0 5,0 1,5 1,5

A técnica consistiu na inoculação, sob assepsia, nas quintuplicatas de cada diluição, sendo 0,5 mL da amostra previamente homogeneizada em água de diluição, em tubos de ensaio contendo 4,5 mL de meio de cultura. Este processo foi repetido até que se obteve o número desejado de diluições nos tubos de ensaio (10-10) (Figura A2).

Figura A2: Esquema da diluição em quintuplicatas para determinação de bactérias desnitrificantes, nitrificantes e grupo coliformes.

Fonte: Maintinguer (2009), modificado

Após a inoculação os tubos de ensaios foram vedados com tampas de borracha e incubados a 30ºC pelo período de 30 dias (Figura A3).

Figura A3: Incubação das bactérias desnitrificantes em estufa a 30ºC

A análise indireta do consumo de nitrato foi realizada, a partir da adição de difenilamina ácida, a qual indicou a presença de nitrato. Após o período de incubação foi retirado 0,4 ml de cada tubo de ensaio inoculado com o auxilio de uma seringa estéril e colocado em outro tubo de ensaio. Foi adicionado de 2 a 3 gotas da solução de difenilamina ácida, a qual quando oxidada transforma-se em difenilbenzidina e posteriormente em sal denominado quinoidiamonium com coloração azulada. Sendo assim, a ausência de coloração indicou resultado positivo, ou seja, consumo de nitrato e, a coloração azul indicou resultado negativo, presença de nitrato.

Para a realização da solução de difenilamina pesou-se 200 mg deste reagente acrescentando-se ácido sulfúrico concentrado até completar 100 mL. Essa solução ficou armazenada em recipiente escuro, tampado e sob refrigeração. Todo procedimento de preparo e manuseio foi realizado em capela.

A contagem do número mais provável (NMP) das bactérias desnitrificantes foi realizada, combinando-se os tubos positivos, ausência de nitrato (incolor) em comparação com os negativos, presença de nitrato (azul) e verificando-se na Tabela Padrão de Probabilidade (Anexo A) e calculando-se o NMP por meio da equação 8:

NMP/100mL = Valor NMP (tabela em anexo) x 10 (eq. 8) Maior diluição da combinação de tubos positivos

A estimativa da população de bactérias nitrificantes foi realizada através de diluições seriadas utilizando o meio descrito por Schmidt e Belser (1982) o qual foi adaptado para amostras líquidas.

O processo de nitrificação ocorre em duas etapas: a nitritação e a nitratação. A nitritação é a formação de nitrito após consumo de nitrogênio amoniacal, pelas bactérias oxidadoras de amônia, enquanto que a nitratação é a formação de nitrato após consumo do nitrito, pelas bactérias oxidadoras de nitrito.

Assim a determinação do NMP das bactérias nitrificantes foi realizada também em duas etapas: o NMP das bactérias oxidadoras de amônia e o NMP das bactérias oxidadoras de nitrito.

Para a realização da determinação destes dois tipos de bactérias, primeiramente foram feitas todas as soluções estoques necessárias no preparo do meio de cultura, as quais foram colocadas em frascos de vidro ambar e armazenadas sob refrigeração. A concentração destas soluções encontra-se na tabela A8.

Tabela A8: Concentração das soluções estoque utilizadas para o preparo do meio de cultura das bactérias oxidadoras de amônia e nitrato.

Constituinte Químico Concentração da Solução Estoque (NH4)2SO4 CaCl2.2H2O NaNO2/KNO2 MgSO4.7H2O Azul de Bromotimol K2HPO4 KH2PO4 Ferro Quelante Fe.SO4.7H2O EDTA dissolvido Elementos Traço NaMoO4.2H2O MnCl2 CoCl2.6H2O ZnSO4.7H2O Cu.SO4.5H2O 5g / 100ml 1,34g /100ml 0,69g / 100ml 4g / 100ml 0,04g /100ml 3,48g /100ml 2,72g / 100 ml em 100ml 0,246g 0,331g em 100ml 0,01g 0,02g 0,0002g 0,01g 0,002g

A2.5 Bactérias oxidadoras de Amônia

Realizou-se o preparo do meio de cultura com as soluções listadas na tabela 10, completando o volume para 500 mL com água destilada. O pH do meio foi corrigido com gotas do sobrenadante da solução supersaturada de Na2CO3 em aproximadamente 7,5. Foi adicionado 9 mL do meio de cultura em cada tubo de ensaio, sendo utilizados 5 tubos para cada diluição. Para tamponar a solução utilizamos uma quantidade mínima de CaCO3 (ou bicarbonato de sódio), em cada tubo de ensaio. Os tubos foram tampados com rolhas de algodão e esterilizados em autoclave por 20 minutos sob pressão de 1 atm e temperatura de 121ºC. Para a inoculação adicionou-se 1 mL da amostra previamente diluída sob condição de assepsia, em cada tubo de ensaio contendo o meio de cultura. Esse procedimento foi realizado para cada diluição utilizada, no caso até a diluição 10-10. Os tubos foram incubados a 30oC, por aproximadamente 30 dias.

Após a retirada do material incubado, realizaram-se testes para verificar se o nitrogênio amoniacal foi consumido. Os 5 tubos de cada diluição foram testados separadamente por meio de duas soluções teste:

SOLUÇÃO 1: dissolveu-se 0,5g de sulfanilamida em 100 mL de ácido clorídrico