5. ANALYSIS
5.1.3 Learning & reflection
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1 Int rodução
processo de reparo alveolar t em sido amplament e est udado t ant o em humanos1 como em animais,2 e as pesquisas most ram que as várias subst âncias t est adas em seu int erior levam a um at raso desse processo, porém, em algumas sit uações, essas subst âncias podem evit ar a inst alação de pat ologias como a alveolit e, caract erizada pela desint egração do coágulo com inf ecção das paredes alveolares e ext remament e dolorido.2
Suas causas são: (1) insuf icient e supriment o sangüíneo no alvéolo; (2) aument o da at ividade f ibrinolít ica no coágulo sangüíneo; (3) presença de inf ecção durant e ou após a ext ração; e (4) t rauma do osso alveolar durant e o at o operat ório.3-5 Vários são, t ambém, os seus f at ores predisponent es, t ais como a quant idade de microrganismos present es na cavidade bucal,3 idade,5 uso de cont racept ivos orais,6 local de ext ração e t ipo de dent e ext raído4 e t abaco.7
Nos últ imos anos, a presença de microrganismos anaeróbios t em sido apont ada como um dos principais f at ores responsáveis pela inst alação dest a pat ologia. Tal f at o despert ou o int eresse de vários pesquisadores, inst it uindo t rat ament os que visam ao cont role específ ico de t ais agent es.8-11 Dent re eles, o met ronidazol dest aca-se pelo f at o de eliminar os microrganismos pat ogênicos anaeróbios e não alt erar a f lora aeróbia comensal,8 além de most rar-se pouco irrit ant e ao t ecido
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conj unt ivo subcut âneo de rat o12 e apresent ar compat ibilidade biológica quando em cont at o com o alvéolo dent al inf ect ado de rat o.10, 11
O met ronidazol, um compost o ant iparasit ário e ant ibact eriano, é uma das drogas mais ut ilizadas no mundo.13 Em odont ologia, além da via sist êmica de administ ração, muit os est udos f oram realizados com a aplicação t ópica da droga no t rat ament o das periodont opat ias,14, 15 associada ou não à raspagem e alisament o dent ário,16 e no t rat ament o das alveolit es.10, 11
A past a com met ronidazol a 10%, lidocaína a 2%, ment a e lanolina como veículo f oi ut ilizada apenas em alvéolos inf ect ados,10-12 f at o que sugere uma aplicação em loj as livres de inf ecção inst alada, simulando uma sit uação clínica em que haj a algum f at or predisponent e envolvido, apesar do aparent e est ado de normalidade das paredes alveolares.
Um procediment o experiment al que t em sido ut ilizado para um est udo mais ref inado, direcionado a f ormação de t ecido ósseo durant e o processo de reparação, é a inj eção de f luorocromos em vários períodos dif erent es para a visualização das camadas de t ecido neof ormado. A ut ilização de f luorocromos dif erent es e análise do mat erial ut ilizando dif erent es f ilt ros no microscópio de f luorescência possibilit am a visualização das camadas de t ecido ósseo neof ormado a cada período em que f oi inj et ado o marcador.
Iyama e cols (1997)17 evidenciaram as dif erent es f ases de t ecido ósseo neof ormado em rat os diabét icos que receberam implant es de hidroxiapat it a na t íbia. Foram ut ilizados como f luorocromos a calceína, a
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alizarina e a oxit et raciclina e a visualização dos cort es f oi f eit a em microscópio conf ocal, ut ilizando f ilt ros para f luoresceína (FITC) ou rodamina (TRITC).
Lee e cols (2003)18 ut ilizaram t ambém f luorocromos no processo de reparação, quant if icando microlesões com a mensuração de massa óssea. Foram ut ilizados como f luorocromos oxit et raciclina, alizarina, calceína e xilenol.
Tiling e cols (2004)19 demonst raram, em experiment os f eit os em roedores inf ect ados com St rept ococcus pneumoniae t ipo 3, o local e t empo em que ocorre o início da deposição óssea, at ravés da inj eção de f luorocromos – calceína, xilenol, oxit et raciclina e alizarina.
Em razão da série de pesquisas realizadas em osseoint egração ut ilizando a inj eção de f luorocromos, demonst rando a import ância da dinâmica do processo de reparo ósseo, t orna-se oport una a realização dest e t rabalho.
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2 Proposição
2. Proposição
st e t rabalho t em como propósit o avaliar o processo de reparo em alvéolos dent ários isquêmicos e não- inf ect ados de rat os, após a aplicação de uma past a à base de met ronidazol a 10%, lidocaína a 2%, lanolina como veículo e ment a como aromat izant e, ut ilizando a inj eção de f luorocromos.
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3 Mat erial e Mét odo
3. Material e Método
pós a aprovação obt ida j unt o á Comissão de Ét ica na Experiment ação Animal (CEEA) da Universidade Est adual Paulist a “ Júlio de Mesquit a Filho” , Câmpus Araçat uba, f oram ut ilizados, nest e experiment o, 60 rat os (Rat t us norevegicus al bicans, Wist ar) machos, com idade variando ent re 70 a 90
dias, pesando aproximadament e 250 a 300 gramas.
Procedent es do Biot ério Cent ral da Faculdade de Odont ologia de Araçat uba, os animais f oram t ransport ados ao Biot ério do Depart ament o de Cirurgia e Clínica Int egrada e mant idos em gaiolas comuns, cont endo cinco animais cada. Os animais apresent avam-se, clinicament e, livres de qualquer ent idade pat ológica.
Ant es e durant e a f ase experiment al, os animais receberam ração sólida (Ração At ivada Produt or-Anderson & Clayt on S. A.), com exceção das primeiras 24 horas pós-cirurgia, na qual essa ração f oi t rit urada. Durant e t odo o período experiment al t odos os animais receberam água à vont ade.
Os animais f oram anest esiados com Cloridrat o de Quet amina (Vet aset - Fort Dodge) e Xilazina (Coopazine – Coopers Brasil Lt da), mediant e inj eção int ramuscular, na dosagem de 0,2 e 0,1 ml para cada 250 gramas de peso corpóreo, respect ivament e. Após ant i-sepsia da área cirúrgica com Dermoidine (Gessy Lever Indúst ria Farmacêut ica Lt da.), o
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incisivo superior direit o de cada animal f oi ext raído de acordo com a t écnica descrit a por Okamot o & Russo (1973).2
A part ir daí, t rês grupos experiment ais f oram const it uídos, com 20 rat os em cada um, ou sej a:
Grupo I: reparação normal;
Grupo II: isquemia provocada pela inserção de cone de papel absorvent e embebido em solução de adrenalina 1:1000, por um minut o; e preenchiment o do alvéolo com a past a à base de met ronidazol a 10% (Flagyl, Rhodia Pharma S. A.), lidocaína a 2% (Merrel-Lepet it , Indúst rias Farmacêut icas Lt da), lanolina (Purif arma – Dist ribuidora Química e Farmcêut ica Lt da) como veículo e ment a (Bot ica Ao Veado D’ ouro) como aromat izant e;
Grupo III: o alvéolo f oi preenchido com a past a à base de met ronidazol a 10% (Flagyl, Rhodia Pharma S. A. ) e lidocaína a 2% (Merrel-Lepet it , Indúst rias Farmacêut icas Lt da), ut ilizando lanolina (Purif arma – Dist ribuidora Química e Farmacêut ica Lt da.) como veículo e ment a (Bot ica Ao Veado D’ ouro) como aromat izant e.
Essa past a f oi int roduzida no int erior do alvéolo com o auxílio de seringa Luer plást ica descart ável (Bect on Dickinson Indúst rias Cirúrgicas Lt da), com agulhas previament e preparadas para a melhor adapt ação ao f ormat o alveolar.
As bordas dos alvéolos de t odos os animais f oram coapt adas por meio de sut ura com f io de seda 4.0 (Et hicon), com o obj et ivo de evit ar o deslocament o do coágulo (Grupo I) e da past a empregada (Grupos II e
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III).
Após seis dias f oram iniciadas as inj eções dos f luorocromos (20mg/ Kg de peso corporal) em 15 rat os (5 animais de cada grupo), por via int ramuscular, para post erior análise em microscopia de f luorescência das camadas de t ecido ósseo. Aos 6 dias f oi inj et ada a calceína (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA), aos 15 dias a alizarina (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA) e aos 21 dias a oxit et raciclina (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA). Após 35 dias esses animais f oram sacrif icados por inj eção excessiva de anest ésico.
A eut anásia dos 45 animais rest ant es, divididos em 15 rat os por grupo, f oi realizada nos períodos de 6, 15 e 21 dias após as ext rações, t ambém por inj eção excessiva de anest ésico. Est as peças seguiram o procediment o convencional para coloração com hemat oxilina-eosina, sendo analisadas no microscópio ópt ico binocular JENAMED 2 (Carl-Zeis), com obj et iva de aument o 63X.
Os cort es obt idos dos animais em que f oram inj et ados os f luorocromos f oram f ixadas em solução de f ormalina t amponada a 10% (Reagent es Analít icos - Dinâmica). Após a f ixação, as peças passaram pela et apa de desidrat ação a part ir da seqüência crescent e de álcoois (70, 80, 90 e 100), com t roca de solução a cada 3 dias, sendo agit adas (Agit ador orbit al, Kline CT-150, Cient ec – equipament os para laborat ório) t odos os dias, durant e 4 horas.
Ao t érmino da desidrat ação as peças f oram imersas em acet ona (Synt h) por 24 horas e, na seqüência, iniciaram-se os banhos em
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monômero met il met acrilat o (JET - Art igos Odont ológicos Clássico Lt da, Indúst ria Brasileira), sendo que o primeiro e o segundo banhos t iveram a duração de 24 horas cada. Para a realização do t erceiro banho, f oi acrescent ado ao monômero um cat alizador, no caso, o peróxido de benzoila (Riedel – De Haën AG, Seelze – Hannover) na concent ração de 1%.
Em seguida, as peças f oram colocadas individualment e em t ubos de ensaio com t ampa e permaneceram imersas nest e t erceiro banho at é que o monômero polimerizasse. Est e processo durou aproximadament e 72 horas à t emperat ura ambient e.
Após a polimerização, os blocos com as peças f oram desgast ados em esmeril. Em seguida, est es cort es chegaram a espessura de 100µm, at ravés do desgast e manual em lixas d’ água (3M).
Obt idos os cort es, est es f oram colocados em lâmina de vidro e as lamínulas f oram mont adas ut ilizando o nuj ol (Schering- Plough) como meio de mont agem. Após a f ixação das lamínulas, as bordas f oram isoladas com esmalt e cosmét ico para evit ar o ressecament o dos cort es.
Para análise qualit at iva f oi ut ilizado um microscópio de epif luorescência (Axiophot , Carl Zeiss, Oberkohen, Germany), com f ilt ros específ icos para cada f luorocromo, ou sej a, f ilt ro com f ot omult iplicador no valor de 488 para a calceína, 594 para a alizarina e luz ult aviolet a com f ot omult iplicador no valor de 368 para a oxit et raciclina, correspondent es ao compriment o de onda excit ado por cada f luorocromo.
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Para aquisição das imagens ut ilizou-se uma câmera digit al acoplada a um microscópio de f luorescência e conect ada ao comput ador. Para padronização da análise capt urou-se a região de t erço médio de t odos os alvéolos.
Para ilust ração da dinâmica do processo de reparo alveolar f oi realizada a sobreposição das imagens obt idas a part ir de cada f luorocromo ut ilizado. Para a sobreposição das imagens f oi ut ilizado o aplicat ivo Adobe Phot oshop 7.0.1 (Adobe Syst ems Incorporat ed). Os passos f oram os seguint es: (1) f errament a “ arquivo” e abert ura de uma nova imagem com f undo t ransparent e, 150dpis de resolução e t amanho 22,01 X 17,2cm, respeit ando os dados originais das imagens previament e capt uradas; (2) f errament a “ arquivo” e abert ura das 3 imagens originais; (3) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da oxit et racilcina para o novo arquivo; (4) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da alizarina para sobrepô-la a imagem da oxit et raciclina; (5) ut ilizaçâo da f errament a “ varinha mágica” com t olerância 10 e suavização de serrilhado para selecionar as áreas da imagem não coradas pelo f luorocromo alizarina; (6) f errament a “ delet e” para eliminação da área selecionada; (7) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da calceína para sobrepô-la às out ras duas imagens; (7) ut ilização da f errament a “ varinha mágica” para selecionar as áreas da imagem não corados pelo f luorocromo calceína; (8) f errament a “ delet e” para a eliminação da área selecionada e obt enção da imagem sobrepost a.
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4 Result ado
5. Resultado
ara a descrição dos result ados f oi realizada uma análise qualit at iva dos períodos pós-operat órios, considerando- se as ocorrências verif icada no t erço médio do alvéolo dent al.
A exposição dos achados apont a a dinâmica do processo de reparo alveolar, at ravés das marcações com f luorocromos, que apresent am-se como f aixas represent at ivas do t ecido ósseo f ormado no dia da inj eção, e os f enômenos hist ológicos encont rados, at ravés da coloração com hemat oxilina-eosina.