2.1. Eritrocitos
Los eritrocitos son células anucleadas y representan el tipo celular más abundante y uno de los más especializados del cuerpo humano. Su función principal es la de transportar el oxígeno (O2) hacia los diferentes tejidos del organismo. Los eritrocitos se forman en la médula ósea, y al salir a la circulación pierden el núcleo, los ribosomas y las mitocondrias, por lo que pierden toda capacidad de división, síntesis de proteínas y reacciones oxidativas mitocondriales [117]. Más del 95% de la proteína citoplasmática del eritrocito es hemoglobina (Hb), una hemoproteína que permite la unión reversible del O2 al grupo hemo. La membrana contiene un 40% de lípidos, incluye fosfolípidos y colesterol en un ratio molar 1.2:1 y aproximadamente la mitad de los ácidos grasos son insaturados. La glucosa es el único combustible que utiliza el eritrocito, y ésta es metabolizada a través de glucólisis anaeróbica. Los eritrocitos senescentes son finalmente retirados de la circulación por células fagocíticas, a un ritmo diario de aproximadamente el 1% de eritrocitos circulantes.
A pesar de no contener mitocondrias, y por tanto no producir ROS mitocondriales, los eritrocitos producen continuamente especies reactivas debido principalmente a la elevada tensión de O2 en la sangre arterial y a su elevado contenido en hemo [118]. La principal fuente de ROS en el eritrocito es la hemoglobina, que puede ser autooxidada produciendo O2-·. La reducción del O2 a O2-·
se acompaña de la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina (metHb), proteína que no posee capacidad de unión de O2. La metahemoglobina puede ser reducida de nuevo a hemoglobina por el sistema NADH-citocromo b5-metHb reductasa y, en menor medida, por metHb reductasa NADPH-dependiente [119].
El O2-· generado es dismutado de forma casi inmediata a H2O2, una especie reactiva mucho más estable. El H2O2 puede provocar modificaciones oxidativas en la hemoglobina, que actuarán como señales para la proteólisis [120]. Además, el incremento en los niveles de H2O2 eritrocitarios se ha relacionado con incrementos en los niveles de metHb y peroxidación lipídica. El H2O2 puede a su vez reaccionar con el
O2-·, dando lugar a OH·, molécula altamente reactiva. A pesar de que el estrés oxidativo eritrocitario puede dañar a la propia célula, la liberación de grandes cantidades de ROS al torrente sanguíneo también puede dañar otros componentes de la circulación [121]. La elevada proporción de ácidos grasos insaturados en su membrana, el ambiente rico en oxígeno y los abundantes niveles de Hb hacen de los eritrocitos un tipo celular especialmente susceptible de sufrir daño oxidativo.
Para combatir el estrés oxidativo, los eritrocitos contienen los enzimas SOD, catalasa, GPx y GRd y NADH-metHb reductasa. En el caso del eritrocito, al carecer de mitocondrias, la isoforma de SOD mayoritaria es la Cu/Zn-SOD citoplasmática. La presencia de niveles elevados de SOD permite la eliminación de radicales O2-·
previniendo así la formación de metHb y del peroxinitrito, de forma que la actividad SOD también actúa como reguladora de la biodisponibilidad de óxido nítrico [122]. El H2O2 producido por la SOD puede ser detoxificado por la glutatión peroxidasa y por la catalasa. La GPx es la primera barrera contra el H2O2 en eritrocitos, detoxificándolo cuando éste se encuentra a bajas concentraciones. En cambio, cuando los eritrocitos se enfrentan a niveles incrementados de H2O2 la catalasa adquiere un papel predominante.
Junto con estos sistemas antioxidantes primarios que previenen la generación de radicales o la propagación de las reacciones en cadena, se ha descrito la presencia de otros sistemas secundarios, que incluyen proteasas que degradan selectivamente proteínas oxidadas. Una de éstas es una serina proteasa citoplasmática que en condiciones oxidantes se adhiere a la membrana celular y promueve la degradación de proteínas de membrana [123].
Los eritrocitos también poseen antioxidantes no enzimáticos como las vitaminas C y E, carotenoides y glutatión. Estudios recientes parecen indicar que los eritrocitos son portadores de glutatión por el torrente sanguíneo a partir de la síntesis de novo, proveyendo así un importante sistema de detoxificación en la circulación [124, 125]. El glutatión supone, de hecho, el antioxidante mayoritario en eritrocitos y protege proteínas eritrocitarias importantes como la espectrina, cuya oxidación puede provocar una mayor rigidez de las membranas, y mantiene los grupos sulfidrilo (SH) de la hemoglobina y otros enzimas en su estado reducido [126].
2.2. Linfocitos
Los linfocitos constituyen alrededor del 20-40% de los leucocitos totales y se pueden dividir en 3 poblaciones celulares en base a su función y sus componentes de membrana: linfocitos B, linfocitos T y células natural killer (NK). La función principal de los linfocitos es la de reconocer antígenos específicos y mediar la respuesta
inmunitaria específica o adquirida. Los linfocitos B son los que reconocen en primer lugar el antígeno extraño a través de anticuerpos específicos unidos a su membrana plasmática. Tras el reconocimiento del antígeno, el linfocito B se divide rápidamente para formar linfocitos B de memoria o células plasmáticas, cuya función es la de producir grandes cantidades de anticuerpo contra el antígeno reconocido. Los linfocitos T también pueden reconocer antígenos específicos, pero a diferencia de los linfocitos B sólo reconocen antígenos que se presentan junto a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que reconocen gracias a un receptor específico de estos linfocitos llamado receptor de células T (TCR). Entre los linfocitos T se distinguen tres subpoblaciones: linfocitos T cooperadores (TH o CD4+), linfocitos T citotóxicos (TC o CD8+) y linfocitos T supresores (TS). Cuando un linfocito T reconoce un complejo MHC-antígenos comienza a secretar diferentes citoquinas cuya función será la de activar y regular la función de linfocitos B y TC, macrófagos y otros células que participan en la respuesta inmune. Los linfocitos TC son células efectoras que ejercen una función citotóxica sobre los patógenos extraños, encargándose de su eliminación. Las células natural killer (NK) son una porción minoritaria de linfocitos (aproxidamente el 5-10% de los linfocitos totales circulantes), y son células de mayor tamaño y con gránulos citoplasmáticos. Su función principal es la de eliminar células tumorales o infectadas con virus, en procesos tanto dependientes como independientes de anticuerpos.
La producción de ROS en el sistema inmunitario se ha estudiado principalmente en células fagocíticas como los macrófagos y los neutrófilos. Sin embargo, algunos estudios se han centrado también en la producción de ROS por parte de los linfocitos, y la importancia de estas ROS en la activación del linfocito frente a estímulos inmunitarios. Tras la estimulación de los linfocitos con agentes mitogénicos como el forbol miristato acetato (PMA) o concavalina A (ConA), así como con las señales que estimulan los receptores de las células T (TCR), se produce un incremento en la generación de ROS por parte de estas células [127, 128]. Entre las ROS producidas por el linfocito tras la estimulación de los TCR se encuentran el peróxido de hidrógeno y el anión superóxido, que parecen ser producidos por vías independientes [129]. Las vías a través de las cuales se generan estas especies reactivas en el linfocito han sido muy poco estudiadas hasta el momento, pero se postula que puedan ser similares a las de otros tipos celulares. El metabolismo del ácido araquidónico [130], la mitocondria [131] y la NADPH oxidasa [132] parecen ser algunas de las principales fuentes de ROS por el linfocito tras la activación del TCR. Al igual que ocurre en otros tipos celulares, las ROS producidas tras la estimulación de receptores de membrana parecen estar implicadas en procesos de señalización
celular. A pesar de que se han llevado a cabo pocos estudios sobre la regulación por especies reactivas en el linfocito, entre las dianas de las ROS generadas a este nivel parecen encontrarse las tirosina fosfatasas [128]. Tras la activación del receptor (TCR) comienza una cascada de fosforilaciones sucesivas reguladas por proteínas tirosina quinasas y fosfatasas que acaban con la formación del complejo de señalización. A partir de este complejo se activan diferentes vías de señalización, como la vía de las MAPK o la del NF-kB. En linfocitos, las vías de las MAPK están involucradas en la regulación del ciclo celular, mientras que el NF-kB participa en la regulación de la expresión de numerosos genes inflamatorios [133].
2.3. Neutrófilos
La función principal de los neutrófilos en la respuesta inmune innata es llevada a cabo a través de toda una seria de respuestas rápidas y coordinadas que culminan con la fagocitosis y eliminación de los patógenos [134]. Para ello, los neutrófilos contienen un potente arsenal antimicrobiano que consta de agentes oxidantes, proteinasas y péptidos antimicrobianos, y también producen grandes cantidades de ROS y RNS tales como O2-· y NO· a través de la actividad de sistemas generadores de oxidantes como pueden ser la NADPH oxidasa y la óxido nítrico sintasa [135]. Durante la fagocitosis, el neutrófilo libera en el interior del fagosoma compuestos contenidos en diferentes gránulos (proteasas, fosfolipasas, glucosidasas y lisozimas) y ROS generados en la membrana del propio fagosoma, compartimentalizando así tanto al patógeno como a los productos citotóxicos y facilitando la eliminación del patógeno. A pesar de esta estructuración celular, en condiciones patológicas los compuestos citotóxicos pueden ser liberados al espacio extracelular e inducir daño en los tejidos circundantes [134].
Las principales fuentes de ROS y RNS en el neutrófilo son la NADPH oxidasa, la cadena de transporte electrónico, el metabolismo del ácido araquidónico y las óxido nítrico sintasas. La NADPH oxidasa (NOX) presente en los neutrófilos es un complejo enzimático unido a la membrana que, una vez activado, genera grandes cantidades de ROS [4], en lo que se conoce como la explosión oxidativa (del inglés oxidative burst).
Cuando el neutrófilo está inactivo el enzima se encuentra latente, pero puede ser rápidamente activado por toda una serie de mediadores solubles (péptidos quimioatrayentes y quimioquinas) y determinados estímulos (bacterias y complejos inmunes) que interactúan con los receptores de membrana. Si bien el producto primario de la reacción es el O2-·, éste puede formar rápidamente otras ROS tales como H2O2, OH· y HOCl, y éstas especies reactivas serán liberadas en los fagosomas para oxidar las proteínas y lípidos bacterianos. La aportación de la cadena de
transporte electrónico a la producción de ROS en neutrófilos parece poco importante, ya que son un tipo celular que posee muy pocas mitocondrias.
El metabolismo del ácido araquidónico por las cicloxigenasas y lipoxigenasas también genera ROS. La prostaglandina H sintasa, enzima clave en la síntesis de prostaglandinas, prostaciclinas y tromboxanos, posee actividad cicloxigenasa e hidroperoxidasa, y ésta última es la responsable de la liberación de O2-·. La 5-lipoxigenasa, responsables de la síntesis de leucotrienos, también produce O2
-· [135].
Los neutrófilos también poseen óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), enzima que produce NO·. El NO· puede reaccionar con especies reactivas de oxígeno como el O2-· dando lugar a peroxinitrito, un compuesto potencialmente citotóxico pero que también funciona en la modificación fisiológica por nitrosilación de moléculas de señalización.
Para hacer frente a esta elevada producción de especies reactivas, los neutrófilos poseen un elaborado sistema de defensas antioxidantes, tanto enzimáticas (catalasa, glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa) como no enzimáticas (vitaminas C y E, glutatión). Los neutrófilos contienen cantidades importantes de ascorbato, cuya función es la de preservar la integridad celular y la de del tejido circundante a través de la neutralización de los productos bactericidas producidos durante la explosión oxidativa [136, 137].
3. Situaciones fisiológicas o patológicas con riesgo de generar estrés oxidativo .
3.1. Hiperbaria, hiperoxia y buceo con botella
La hiperoxia es una condición en la cual la concentración de oxígeno se encuentra por encima de los niveles fisiológicos. La terapia con oxígeno hiperbárico (HBO) proporciona una presión de oxígeno del 100%, lo que provoca un incremento en la cantidad de oxígeno disuelto en la sangre y una disminución del tamaño de las burbujas de gas en sangre. Desde que se empezara a usar en 1939, esta terapia ha sido ampliamente utilizada en el tratamiento de diversas enfermedades, como la enfermedad de descompresión o la intoxicación por monóxido de carbono, y para favorecer la cicatrización de heridas y quemaduras [138-140]. Sin embargo, el aumento en los niveles de oxígeno se ha visto que a su vez conlleva un incremento en la concentración de ROS [141], y en la oxidación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos [142-144]. La respuesta celular al HBO se ha estudiado principalmente en modelos animales [145, 146], y sólo recientemente se ha comenzado a estudiar en humanos [147-149]. En todo caso, se ha sugerido que una sesión de HBO puede representar un buen modelo para la investigación del estrés oxidativo en humanos