7 KOMMUNENE ETTER RUSREFORMEN
8.2 Brukerorganisasjoner
A screening fitoquímico de plantas medicinais consiste numa estratégia alternativa para a procura de agentes terapêuticos. Com o intuito de verificar a presença dos principais grupos de metabólitos responsáveis pelas ações biológicas do extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. foram realizados testes de triagem fitoquímica. Os grupos de metabólitos analisados foram alcaloides, flavonoides, terpenos e triterpenos.
O padrão escolhido para o desenvolvimento da cromatografia em camada delgada foi a capsaicina, por ser uma das moléculas responsáveis pela ação biológica de espécies do gênero Capsicum. Os valores dos fatores de retenção (Rfs) para a capsaicina e as amostras estão demonstrados na tabela abaixo (Tabela 3).
Tabela 3 – Valores do fator de retenção (Rf) de capsaicina em extratos acetônicos de
Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Rf padrão capsaicina Rf extrato acetônico Imaturo 0,328 0,325 Intermediário 0,317 - Maduro 0,318 -
Figura 29 – Placa cromatográfica do extrato acetônico de frutos maduros de Capsicum baccatum L. após a revelação com Reagente de Dragendorff. Em destaque o padrão de capsaicina e a presença dessa
substância nos extratos. Fonte: Arquivo pessoal dos pesquisadores.
Em dois estádios de maturação (intermediário e maduro) não foram observadas bandas na cromatografia em camada delgada realizada dos extratos acetônicos que correspondessem à capsaicina (Figura 29). Esse fato pode ter ocorrido pela quantidade insuficiente de extrato utilizada durante a cromatografia, pela inexistência ou menor concentração dessa substância nos estádios de maturação especificados.
No estádio imaturo de maturação, foram detectadas bandas cromatográficas com valores de Rf semelhantes ao padrão aplicado (diferença menor que 0,05) em três das quatro repetições realizadas dos extratos acetônicos, caracterizando a presença desse capsaicinoide nesse estádio.
Segundo TOPUZ & OZDEMIR (2007) a concentração de metabólitos secundários encontrados em espécies de Capsicum sofre influência do genótipo e do grau de maturação dos frutos.
Os componentes responsáveis pelo sabor e pela pungência das pimentas do gênero Capsicum são sintetizados pela via do ácido cinâmico e eles são degradados, conforme a maturação, por ação das enzimas peroxidases. A concentração de capsaicina nos frutos das
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capsaicina
espécies do gênero Capsicum, dentre elas a espécie Capsicum baccatum L. aumenta com a maturidade dos frutos, sofrendo um rápido decréscimo no estádio maduro. Isso ocorre devido à presença da enzima peroxidase na placenta dos frutos (CONTRERAS-PADILLA, 1998).
Portanto, a presença da capsaicina na placa cromatográfica do extrato acetônico de pimenta dedo-de-moça no estádio imaturo e a ausência nos demais estádios, colabora para reforçar os dados encontrados na literatura.
Os terpenos são metabólitos secundários de plantas cuja origem biossintética seja derivada de unidades do isopreno (PASSOS et al., 2009).
Muitos derivados monoterpênicos, dentre eles o linalol, limoneno e citronelol possuem ação anticonvulsivante e antinoceptiva (PASSOS et al., 2009).
O timol é um composto fenólico derivado do fenilpropano que apresenta propriedades carminativas, anti-espasmódica, antisséptica, expectorante e antiinflamatória (BRECKENFIELD et al., 2005).
Saponinas são glicosídeos de esteróides ou de terpenos policíclicos. Este tipo de estrutura determina a propriedade de redução da tensão superficial da água e sua ação detergente e emulsificante (LÓPEZ, 2010).
Tabela 4 – Valores de Rf do timol em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Rf padrão timol Rf extrato acetônico Imaturo 0,502 0,502 Intermediário 0,502 0,500 Maduro 0,573 0,568
Tabela 5 – Valores de Rf do linalol em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Rf padrão linalol Rf extrato acetônico Imaturo 0,325 0,354 Intermediário 0,390 0,390 Maduro 0,450 0,446
Tabela 6 – Valores de Rf do saponina em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Rf padrão saponina Rf extrato acetônico Imaturo 0,753 0,753 Intermediário 0,760 0,763 Maduro 0,768 0,770
As placas cromatográficas contendo os extratos nos três estádios de maturação apresentaram bandas alinhadas com os três padrões utilizados, indicando a presença de compostos nos extratos com cadeia fechada, anel aromático e com cadeia lateral ramificada, correspondentes às bandas das saponinas, do timol e linalol, respectivamente. Logo, há presença de terpenos e triterpenos nessa amostra de pimenta dedo-de-moça nos estádios imaturo, intermediário e maduro. No entanto, não se pode afirmar que os terpenos encontrados no extrato acetônico dos frutos verdes de Capsicum baccatum L. são o timol e o linalol por serem produtos altamente voláteis e degradados a altas temperaturas, como a usada para o processo de concentração do extrato.
Os flavonoides são compostos fenólicos biossintetizados a partir da via dos fenilpropanoides, presentes entre os metabólitos secundários dos vegetais.
A quercetina é um flavonoide abundante na natureza, podendo ser encontrado em muitas plantas, tais como: cebola, brócolis e pimentas (MARTINEZ, 2008). Portanto, esse flavonoide foi o escolhido como padrão para o desenvolvimento da cromatografia em camada delgada dos extratos de Capsicum baccatum L. nos três estádios de maturação (Tabela 7).
Tabela 7 – Valores de Rf da quercetina em extratos acetônicos de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Rf padrão quercetina Rf extrato acetônico Imaturo 0,41 0,37 Intermediário 0,46 0,45 Maduro 0,41 0,39
A detecção de bandas amareladas reveladas com vanilina sulfúrica indica a presença de compostos da subclasse dos flavonois, que são flavonoides oxigenados, substituídos com hidroxilas e/ou metoxilas, nos extratos acetônicos de Capsicum baccatum L. nos três estádios de maturação. Dentre os flavonois, podem ser citados a quercetina, miracetina e kaempferol (BEHLING et al., 2004).
Vários estudos demonstram a presença de flavonoides em espécies de pimenta do gênero Capsicum, sendo os mais citados quercetina e miricetina (KAPPEL, 2007).
Portanto, a presença da quercetina na placa cromatográfica do extrato acetônico de pimenta dedo-de-moça nos três estádios de maturação, colabora para reforçar os dados encontrados na literatura.
5.7. Quantificação de capsaicina nos extratos orgânicos obtidos dos frutos de Capsicum
baccatum L. em três estádios diferentes de maturação
As espécies do gênero Capsicum são caracterizadas pela presença de um grupo de substâncias conhecidas como capsaicinoides. Os capsaicinoides são substâncias derivadas de compostos fenilpropanoides que apresentam diversidade química e estrutural. Dos capsaicinoides conhecidos, podem ser citados a capsaicina, dihidrocapsaicina e nordihidrocapsaicina. Desses, a capsaicina é responsável por 90% da pungência e das atividades biológicas apresentadas pelo gênero (PERUCKA, 2000). Por esse motivo, a capsaicina foi quantificada nos três estádios de maturação dos frutos de Capsicum baccatum L. a fim de determinar em qual estádio de maturação ela encontra-se em maior quantidade.
Para que a capsaicina fosse quantificada com efetividade e segurança, tornou-se necessário validar a metodologia utilizada. A validação do método de quantificação da capsaicina por CLAE consistiu nas etapas: detecção no ultravioleta (UV), linearidade, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez. Para isso, o sistema cromatográfico utilizado foi Waters Alliance 2695, detector Waters UV-visível 2996, coluna C18 Waters Symmetry (150mmx4,6mmx5um), comprimento de onda 281nm, temperatura 30ºC, fluxo 1mL/min., volume de injeção 50µL e concentração da capsaicina padrão 16µg/mL.
Os resultados encontrados indicaram que a capsaicina absorve luz ultravioleta no comprimento de onda de 280,4nm (Figura 30) e que a fase móvel mais eficaz para sua eluição, que apresente um pequeno tempo de retenção e uma boa resolução foi acetonitrila:água (60:40) (Figura 31).
Figura 30 – Espectro de absorção da capsaicina na luz ultravioleta visível. Padrão de capsaicina. Fase móvel acetonitrila: água (60:40) e detector UV-visível Waters 2996. Fonte: Arquivo pessoal do
pesquisador.
Figura 31 – Cromatograma do padrão de capsaicina. Fase móvel acetonitrila: água (60:40) e detector UV-visível Waters2996. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
Para a construção da linearidade, o padrão de capsaicina foi eluído nas concentrações de 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500µg/mL (Figura 32), obtendo a equação da reta y = 27,652x + 16,313 e o coeficiente de determinação de r2 foi de 0,9996.
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 capsaicina A bs or bâ nc ia ( 28 1 nm ) I nt en si da de u ltr av io le ta ( A U ) Absorbância (nm) Tempo (minutos)
Figura 32 – Espectro de absorção da capsaicina na luz ultravioleta visível. Padrão de capsaicina nas concentrações de 10, 25, 50, 100, 200, 400 e 500µg/mL. Fase móvel acetonitrila: água (60:40) e detector
UV-visível Waters 2996. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
O método desenvolvido foi considerado linear por apresentar valor de r2= 0,9996 e apresentou valores de exatidão de 92,09% a 103,39% e de precisão de 0,46% a 10,10%.
Depois da validação da metodologia empregada, a concentração de capsaicina nos três estádios de maturação da pimenta dedo-de-moça foi quantificada (Tabela 8).
Tabela 8 – Concentrações médias de capsaicina nos extratos acetônicos de Capsicum
baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Concentração de capsaicina (µg/mL)
Imaturo 60,51*
Intermediário 60,80*
Maduro 55,53
Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) com grau de significância p 0,05, considerando estatisticamente iguais as concentrações de capsaicina
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 3,00 3,20 3,40 3,60 3,80 4,00 4,20 4,40 4,60 4,80 5,00 5,20 5,40 5,60 5,80 6,00 Tempo (minutos) A bs or bâ nc ia ( 28 1n m )
nos estádios imaturo e intermediário de maturação, sendo a concentração deste metabólito inferior no estádio maduro.
A concentração de capsaicina nos frutos das espécies do gênero Capsicum, dentre elas a espécie Capsicum baccatum L. aumenta com a maturidade dos frutos, sofrendo um rápido decréscimo no estádio maduro. Isso ocorre devido à presença da enzima peroxidase na placenta dos frutos (CONTRERAS-PADILLA, 1998).
Portanto, a menor concentração de capsaicina no estádio maduro dos frutos de Capsicum baccatum L. é encontrada devido à degradação desse metabólito durante a maturação dos frutos.
A concentração de capsaicina encontrada no extrato acetônico dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. são superiores àquele encontrado no estádio maduro, confirmando os dados encontrados na literatura.
5.8. Quantificação dos constituintes fenólicos totais
Compostos fenólicos são substâncias altamente reativas quimicamente, responsáveis por uma grande variedade de ações biológicas em plantas utilizadas com fins medicinais. Além de contribuírem no sabor, odor e na coloração de diversos vegetais, possuem atividade antioxidante pronunciada, atividade antibacteriana e antiviral, inibição da 5-lipoxigenase (SIMÕES et al., 2004). Portanto, são compostos que se destacam por produzir atividade farmacológica em um grande número de espécies vegetais.
Determinar os níveis de compostos fenólicos em tecidos vegetais constitui a etapa inicial de qualquer pesquisa de atividade fisiológica, visando a prevenção e tratamento de doenças. A capacidade redutora desses compostos pode ser utilizada para direcionar a quantificação inicial (FURLONG et al., 2003).
Para determinação dos compostos fenólicos nos três estádios de maturação (imaturo, intermediário e maduro) dos frutos de Capsicum baccatum L. foi construída a curva de calibração.
A curva de calibração de compostos fenólicos foi construída com o ácido tânico em concentrações de 20, 30, 40, 50 e 60µg/mL. Para cada ponto foram realizadas quatro replicatas (Figura 33).
Curv a de Calibração de compostos fe nólicos
0 20 40 60 80 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 r2= 0,991 y = 0,007x - 0,003
Conce ntração ácido tânico (µµµµg)
A b s o rv â n c ia 2 6 5 n m
Figura 33 – Curva de calibração de compostos fenólicos. Padrão ácido tânico. Fonte: Arquivo pessoal do pesquisador.
O método apresentou-se linear caracterizado por equação da reta y = 0,007x – 0,003 e coeficiente de determinação r2= 0,991.
Os valores encontrados para a concentração de compostos fenólicos em extratos acetônicos dos frutos de Capsicum baccatum L. em diferentes estádios de maturação foram submetidos à análise de variância (ANOVA – one way) com grau de significância para p 0,05 e estão representados na tabela abaixo (Tabela 9).
Tabela 9 – Valores médios da concentração de compostos fenólicos em extratos em acetona de Capsicum baccatum L. em três diferentes estádios de maturação
Estádios de maturação Peso (g) Absorbância (765nm) Concentração Compostos Fenólicos (µg/mg de amostra) Verde 0,0023 0,304 39,83* Intermediário 0,0021 0,175 21,67 Maduro 0,0021 0,239 31,67
* Diferença significativa com relação aos outros grupos após análise de variância (ANOVA)
O extrato acetônico dos frutos de Capsicum baccatum L. no estádio imaturo, obtido pelo método de maceração exaustiva, foi o que apresentou a maior concentração de compostos fenólicos (39,83µg/mg de amostra), sendo estatisticamente superior e diferente da concentração encontrada nos estádios intermediário e maduro.
As pimentas do gênero Capsicum apresentam uma diversidade de compostos químicos conhecidos como compostos fenólicos, dos quais podem ser destacados os flavonoides, capsaicinoides, ácidos fenólicos, dentre outros (KAPPEL, 2007).
A maior concentração de compostos fenólicos no extrato acetônico produzido a partir dos frutos imaturos de Capsicum baccatum L. é justificada pela maior concentração de capsaicina nesse estádio de maturação e a presença do flavonoide quercetina. Esses dados confirmam o resultado de vários estudos que encontraram mudança na composição química influenciada pelo processo de maturação em espécies do gênero Capsicum (DEEPA et al., 2006, KAPPEL, 2007, MÓRAN-BAÑUELOS, 2008).
5.9. Atividade antioxidante
A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à ação dos radicais livres ou espécies reativas de oxigênio (ERO) no organismo. Elas podem ser geradas por fontes endógenas e exógenas. Por fontes endógenas, originam-se de processos biológicos normalmente do organismo, tais como: redução da flavinas e tióis; resultado da atividade de oxidases, ciclooxigenases, lipoxigenases, desidrogenases e peroxidases, presença de metais de transição no interior da célula e de sistemas de transporte de elétrons (SOARES, 2002).
Muitas doenças e processos degenerativos podem ser associados ao aumento na produção das ERO no organismo, podendo ser incluídos: inflamação, isquemia cerebral, mutagênese, câncer, demência e processos relacionados à idade fisiológica (SAVEGNAGO, 2006).
Antioxidantes fenólicos funcionam como seqüestradores de radicais livres e algumas vezes como quelantes de metais, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo (SOARES, 2002).
A atividade antioxidante dos extratos acetônicos nos estádios imaturo, intermediário e maduro apresentou valor médio de 72,90 ±1,52%. O padrão butilhidroxianisol (BHA) nas concentrações de 5, 10, 25, 50 e 75µg/mL, demonstrou valores de atividade antioxidante estatisticamente igual à atividade antioxidante dos extratos acetônicos de Capsicum baccatum L. no estádio imaturo nas concentrações de 5, 10, 25, 50 e 75µg/mL. Os demais extratos acetônicos nos estádios intermediários e maduro apresentaram valores inferiores ao padrão e ao extrato acetônico imaturo (Figura 34).
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS ACETÔNICOS DA PIMENTA