Como dito anteriormente, o SP dos indivíduos do grupo controle e dos pacientes onco- hematológicos foi coletado em tubos próprios contendo heparina sódica como anticoagulante, e em eventuais situações, coletado e analisado em anticoagulante EDTA.
Para padronizar, unificar e validar os resultados de maneira independente do anticoagulante utilizado foi feito um comparativo das características fenotípicas dos linfócitos T em SP colhido nesses diferentes tipos de anticoagulante, com o intuito final de identificar possíveis diferenças.
Para isso, foi coletado e analisado SP de um indivíduo controle, de um paciente com SMD e outro com LLC, tanto em heparina como em EDTA, para então podermos comparar os resultados fenotípicos, os quais estão representados nas Figuras 7, 8 e 9, respectivamente.
Figura 6 - Representação da análise do PBMC e estratégia de gates sequenciais a partir de SP
de indivíduo do grupo controle.
5x105 células totais de PBMC foram marcadas com anticorpos monoclonais de superfície CD45RA
FITC, CD62L PE, CD3 PerCP, CD4 APC-Cy7 e CD8 PE-Cy7, e analisadas por citometria de fluxo (FACS Canto II e FlowJo). (Gate A) Região de linfócitos a partir dos parâmetros de tamanho (FSC) versus complexidade (SSC). (Gate B) População de linfócitos T CD4+ (46.86%) determinada pela dupla positividade dos marcadores CD3+CD4+ em região de linfócitos determinada pelo gate A. (Gate C) População de linfócitos T CD8+(20,81%) determinada pela dupla positividade de CD3+CD8+em região de linfócitos determinada pelo gate A. Expressão antigênica de CD45RA e CD62L nas populações de linfócitos T CD4+(A e B) e CD8+ (A e C) possibilitando a identificação e estimativa das células T com
fenótipo naive (CD45RA+ CD62L+), T
CM (CD45RA- CD62L+), TEM (CD45RA- CD62L-) e TEMRA (CD45RA+
Figura 7 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de indivíduo do grupo controle.
Sangue periférico de indivíduo do grupo controle colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 7 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de indivíduo do grupo controle.
Sangue periférico de indivíduo do grupo controle colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 7 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de indivíduo do grupo controle.
Sangue periférico de indivíduo do grupo controle colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 8 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com SMD.
Sangue periférico de paciente com SMD colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 8 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com SMD.
Sangue periférico de paciente com SMD colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 8 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com SMD.
Sangue periférico de paciente com SMD colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Figura 9 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com LLC.
Sangue periférico de paciente com LLC colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Dessa forma, como visualizado nas figuras acima, as proporções fenotípicas dos linfócitos T dos indivíduos controle e de pacientes onco-hematológicos, são independentes do anticoagulante de escolha para coleta das amostras de SP.
Figura 9 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com LLC.
Sangue periférico de paciente com LLC colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Dessa forma, como visualizado nas figuras acima, as proporções fenotípicas dos linfócitos T dos indivíduos controle e de pacientes onco-hematológicos, são independentes do anticoagulante de escolha para coleta das amostras de SP.
Figura 9 - Anticoagulantes heparina e EDTA não alteram as proporções fenotípicas dos
linfócitos T de paciente com LLC.
Sangue periférico de paciente com LLC colhido em anticoagulantes heparina e EDTA para obtenção de PBMC e posterior fenotipagem dos linfócitos T. (A) Frequência dos LTCD4 e LTCD8 em heparina e EDTA. Frequência dos LTCD4 (B) e LTCD8 (C) naive e subtipos de memória em heparina e EDTA. Teste estatístico ANOVA (two-way ANOVA) com valores de p>0.05.
Dessa forma, como visualizado nas figuras acima, as proporções fenotípicas dos linfócitos T dos indivíduos controle e de pacientes onco-hematológicos, são independentes do anticoagulante de escolha para coleta das amostras de SP.