Alternative Quality Criteria of “Good” Research

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3 Mat erial e Mét odo

3. Material e Método

pós aprovação da Comissão de Ét ica na Experiment ação Animal (CEEA) da Universidade Est adual Paulist a “ Júlio de Mesquit a Filho” , Câmpus Araçat uba, f oram ut ilizados, nest e experiment o, 5 rat os (Rat t us norevegicus al bicans, Wist ar) machos, com idade variando ent re 70 a 90

dias, pesando aproximadament e 250 a 300 gramas.

Procedent es do Biot ério Cent ral da Faculdade de Odont ologia de Araçat uba, os animais f oram t ransport ados ao Biot ério do Depart ament o de Cirurgia e Clínica Int egrada e mant idos em gaiolas comuns. Os animais apresent avam-se, clinicament e, livres de qualquer ent idade pat ológica.

Ant es e durant e a f ase experiment al, os animais receberam ração sólida (Ração At ivada Produt or-Anderson & Clayt on S. A.), com exceção das primeiras 24 horas pós-cirurgia, na qual essa aliment ação f oi t rit urada. Durant e t odo o período experiment al t odos os animais receberam água à vont ade.

Os animais f oram anest esiados com Cloridrat o de Quet amina (Vet aset - Fort Dodge) e Xilazina (Coopazine – Coopers Brasil Lt da), mediant e inj eção int ramuscular, na dosagem de 0,2 e 0,1 mL para cada 250 gramas de peso corpóreo, respect ivament e. Após ant i-sepsia da área cirúrgica com Dermoidine (Gessy Lever Indúst ria Farmacêut ica Lt da.), o incisivo superior de cada animal f oi ext raído de acordo com a t écnica descrit a por Okamot o e Russo (1973).5

A

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As bordas dos alvéolos de t odos os animais f oram coapt adas por meio de sut ura com f io de seda 4.0 (Et hicon), com o obj et ivo de evit ar o deslocament o do coágulo.

Após seis dias f oram iniciadas as inj eções dos f luorocromos (20mg/ Kg de peso corporal) por via int ramuscular, para post erior análise em microscopia de f luorescência das camadas de t ecido ósseo. Aos 6 dias f oi inj et ada a calceína (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA), aos 15 dias a alizarina (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA) e aos 21 dias a oxit et raciclina (Sigma Chemical St . Louis, MO, USA). A eut anásia dos animais f oi realizada após 35 dias por inj eção excessiva de anest ésico.

As peças obt idas f oram f ixadas em solução de f ormalina t amponada a 10% (Reagent es Analít icos - Dinâmica). Após a f ixação, as peças passaram pela et apa de desidrat ação a part ir da seqüência crescent e de álcoois (70, 80, 90 e 100), com t roca de solução a cada 3 dias, sendo agit adas (Agit ador orbit al, Kline CT-150, Cient ec – equipament os para laborat ório) t odos os dias, durant e 4 horas.

Ao t érmino da desidrat ação as peças f oram imersas em acet ona (Synt h) por 24 horas e, na seqüência, iniciaram-se os banhos em monômero met il met acrilat o (JET - Art igos Odont ológicos Clássico Lt da, Indúst ria Brasileira), sendo que o primeiro e o segundo banhos t iveram a duração de 24 horas cada. Para a realização do t erceiro banho, f oi acrescent ado ao monômero um cat alizador, o peróxido de benzoila (Riedel – De Haën AG, Seelze – Hannover) na concent ração de 1%.

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de ensaio com t ampa e permaneceram imersas nest e t erceiro banho at é que o monômero polimerizasse. Est e processo durou aproximadament e 72 horas à t emperat ura ambient e.

Após a polimerização, os blocos com as peças f oram desgast ados em esmeril. Em seguida, est es cort es chegaram a espessura de 100µm, at ravés do desgast e manual em lixas d’ água (3M).

Os cort es obt idos f oram colocados em lâmina de vidro e as lamínulas f oram mont adas ut ilizando o nuj ol (Schering- Plough) como meio de mont agem. Após a f ixação das lamínulas, as bordas f oram isoladas com esmalt e cosmét ico para evit ar o ressecament o dos cort es.

Para análise qualit at iva f oi ut ilizado um microscópio de epif luorescência (Axiophot , Carl Zeiss, Oberkochen, Germany), com f ilt ros específ icos para cada f luorocromo, ou sej a, f ilt ro com f ot omult iplicador no valor de 488 para a calceína, 594 para a alizarina e luz ult aviolet a com f ot omult iplicador no valor de 368 para a oxit et raciclina, correspondent es ao compriment o de onda excit ado por cada f luorocromo.

Para aquisição das imagens ut ilizou-se uma câmera digit al acoplada a um microscópio de epif luorescência (Axiophot , Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) e conect ada ao comput ador. Para padronização da análise capt urou-se a região de t erço médio de t odos os alvéolos.

Para ilust ração da dinâmica do processo de reparo alveolar f oi realizada a sobreposição das imagens obt idas a part ir de cada f luorocromo ut ilizado. Para a sobreposição das imagens f oi ut ilizado o

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aplicat ivo Adobe Phot oshop 7.0.1 (Adobe Syst ems Incorporat ed). Os passos f oram os seguint es: (1) f errament a “ arquivo” e abert ura de uma nova imagem com f undo t ransparent e, 150dpis de resolução e t amanho 22,01 X 17,2cm, respeit ando os dados originais das imagens previament e capt uradas; (2) f errament a “ arquivo” e abert ura das 3 imagens originais; (3) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da oxit et racilcina para o novo arquivo; (4) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da alizarina para sobrepô-la a imagem da oxit et raciclina; (5) ut ilização da f errament a “ varinha mágica” com t olerância 10 e suavização de serilhado para selecionar as áreas da imagem não coradas pelo f luorocromo alizarina; (6) f errament a “ delet e” para eliminação da área selecionada; (7) f errament a “ mover” para selecionar e arrast ar a imagem da calceína para sobrepô-la às out ras duas imagens; (7) ut ilização da f errament a “ varinha mágica” para selecionar as áreas da imagem não corados pelo f luorocromo calceína; (8) f errament a “ delet e” para a eliminação da área selecionada e obt enção da imagem sobrepost a.