Vedlegg 4: Referanser – resultat av systematisk gjennomgang

A LV é uma das mais relevante e emergente doença, com aproximadamente 98% de mortalidade dos casos humanos não tratados, apresentando-se como uma importante zoonose distribuída em áreas tropicais e subtropicais do globo (Tesh, 1995, Desjeux, 2004). Além disto, os cães são considerados o principal reservatório da L. chagasi/L. infantum na América Latina e Europa (Deane & Deane, 1962). Assim, considerando que a

quimioterapia em cães ainda não proporciona cura parasitológica, o emprego de vacinas anti-LVC é considerada a melhor alternativa no combate a crescente expansão e urbanização da doença e poderá contribuir efetivamente nos programas de controle da LV (Abranches et al.,1991, Genaro, 1993; Mayrink et al., 1996; Palatinik et al., 2001; Gradoni, 2001; Handman, 2001; Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008c; Reis et al., 2008). Muitos estudos com candidatos a vacinas para a imunoprofilaxia da LVC

descrevem a utilização de diferentes antígenos, apresentando resultados estimulantes e indicando que o desenvolvimento de uma vacina efetiva contra LVC é possível (Mayrink et al., 1996, Lemesre et al., 2005; Giunchetti et al., 2007a,b; Gradoni, 2001; Palatnik et al.,

1994a;Giunchetti et al., 2007; Giunchetti et al., 2008).

Considerando a importância dos imunobiológicos (LEISHMUNE® e LBSap) na imunoprofilaxia da LVC, o papel do hamster como modelo experimental para LV e mais recentemente em estudos de vacinas (Garg and Dube, 2006), torna-se fundamental a busca de conhecimentos dos processos relacionados à resposta imune inicial desencadeada logo após as sensibilizações utilizando estas vacinas e de seus componentes isoladamente. Assim, no presente trabalho, foram avaliadas as alterações induzidas pela utilização dos diferentes inóculos, utilizando como estratégia a avaliação das alterações histopatológicas, do perfil celular no sangue periférico e da participação do NO sérico e da iNOS presente na região do inóculo dérmico. Para melhor compreensão dos resultados obtidos neste

trabalho, optamos para denominar de período precoce os tempos de 1, 12 e 24 horas e de período tardio os tempos de 48, 96 e 168 horas, durante a cinética avaliada.

Na literatura ainda são escassos os trabalhos que têm avaliado especificamente a cinética da migração celular, após sensibilizações, utilizando diferentes formulações de vacinas e adjuvantes. O caráter inovador deste trabalho se propõe a buscar ferramentas e modelos experimentais de estudos contribuindo assim na seleção de potenciais antígenos e adjuvantes vacinais. Neste sentido, a avaliação das alterações no local do inóculo vacinal, seja pelo estudo histopatológico ou de NO, representariam biomarcadores importantes para análise da inocuidade vacinal, pela compreensão das alterações in situ, para propor potenciais candidatos vacinais em ensaios clínicos de campo. Desta forma, Sesardic (2006) propõe a avaliação de estudos pré-clínicos para a identificação da melhor composição vacinal, que se apresente inócua e segura, como controle de qualidade adicional para o desenvolvimento de candidatos vacinais.

Em uma primeira abordagem foi avaliado o impacto no sangue periférico de hamsters sensibilizados com as vacinas LBSap e LEISHMUNE®, o adjuvante saponina e o antígeno de L. braziliensis isoladamente (LB). Os resultados obtidos a partir da contagem de leucócitos nos esfregaços do sangue periférico em diferentes momentos da cinética demonstraram que houve redução precoce de neutrófilos no grupo LEISHMUNE® (1 hora) em relação ao grupo LB e aumento precoce no grupo SAPONINA (24 horas) comparado ao antígeno LB e SALINA. Além disto, foi observado uma participação tardia (168 horas) desta população celular nos grupos LEISHMUNE®, LBSap e LB em relação ao grupo SALINA. Giunchetti (2007) avaliou aspectos da resposta celular em cães submetidos ao inóculo com saponina, antígeno de L. braziliensis, a vacina LBSap. Neste estudo, foi demonstrado aumento de neutrófilos circulantes no grupo LB em relação ao grupo controle 15 dias após a primeira imunização. Estes resultados sugerem a participação da resposta

imune inata, com ênfase na população de neutrófilos, nos eventos iniciais após o inóculo vacinal utilizando o imunobiológico LBSap.

Além disto, é importante ressaltar que os neutrófilos representam a primeira linha de defesa na resposta imune em processos inflamatórios frente à infecção por patógenos intracelulares (Montenegro & Fecchio, 1999; Van Gisbergen et al., 2005; Ribeiro-Gomes et al., 2004). No sítio inflamatório, estas células liberam enzimas e mediadores que alteram

a matriz extracelular e atraem outras células inflamatórias tais como eosinófilos, monócitos, linfócitos T, linfócitos B, células NK, células dendríticas (Ribeiro-Gomes et al., 2004). Recentes estudos realizados no modelo murino demonstraram o papel dos

neutrófilos no controle da infecção por L. donovani. Nestes estudos, foi observado em camundongos com depleção de neutrófilos, aumento do número de parasitos no baço e medula óssea, associado a elevados níveis de IL-4 e IL-10 e redução de IFN-γ por células CD4+ e CD8+ direcionando a uma resposta do tipo 2 (McFarlame et al. 2007; Murray & Nathan, 1999). Neste contexto, os neutrófilos assumem um papel fundamental na resposta protetora inicial contra L. donovani. De forma similar, a análise dos resultados relacionada ao aumento do percentual de neutrófilos demonstrado no grupo SAPONINA em 24 horas, sugere a participação desta célula no contexto da imunidade inata, logo após a sensibilização com este adjuvante. Esta migração de neutrófilos em direção ao inóculo, estimulada pelo adjuvante saponina, poderia favorecer o estabelecimento de uma resposta imune do tipo 1, fundamental para vacinas contra patógenos intracelulares.

Neste trabalho não observamos nenhuma diferença na população de eosinófilos no sangue periférico durante a cinética avaliada. Entretanto, Giunchetti (2007) demonstrou que cães imunizados com a vacina LBSap apresentaram aumento do número de eosinófilos (15 dias após a segunda imunização) em relação aos cães imunizados com saponina. Além disto, foi observado em cães do grupo LB aumento de eosinófilos em relação ao grupo

controle (15 dias após a terceira imunização) (Giunchetti, 2007). A ausência de alterações na população de eosinófilo circulantes neste trabalho poderia ser explicada pelos distintos modelos avaliados, ou ainda em função da diferença dos tempos avaliados após os inóculos, uma vez que no estudo de Giunchetti (2007) as alterações hematológicas foram avaliadas 15 dias após cada dose da vacina, indicando que esta população tem uma mobilização sistêmica mais tardia.

O antígeno de L. braziliensis (LB) demonstrou uma precocidade (12 horas) na mobilização de monócitos circulantes em relação aos hamsters inoculados com SAPONINA e as vacinas LBSap e LEISHMUNE®. Estes resultados parecem indicar a capacidade em induzir um recrutamento mais rápido de monócitos, favorecendo assim os eventos de apresentação antigênica no local do inóculo. Giunchetti (2007) e Giunchetti et al. (2007) mostraram por meio de imunofenotipagem por citometria de fluxo que cães

imunizados com a vacina LBSap apresentam aumento no número de monócitos CD14+ circulantes 15 dias após a segunda imunização e também 15 dias após a terceira imunização. Estudos têm demonstrado que o recrutamento seletivo de monócitos apresenta um papel importante na resposta imune contra infecção por L. major, ao verificar que as células dendríticas diferenciadas de monócitos no sítio de infecção foram as responsáveis pela indução de uma resposta imune protetora (Leon et al., 2005; Leon et al., 2007).

Na análise de linfócitos circulantes observamos que o antígeno de L. braziliensis promove uma redução precoce (1 hora) destas células no sangue periférico em relação à vacina LEISHMUNE®, sugerindo que houve uma reatividade imunológica sistêmica após a imunização. Nos tempos precoces (12 e 24 horas) observamos uma redução de linfócitos circulantes nos grupos SAPONINA e na vacina LEISHMUNE®, e este padrão se repete no período tardio (168 horas) para as duas vacinas LEISHMUNE® e LBSap e ainda no grupo LB. Esta redução precoce de linfócitos na vacina LEISHMUNE®, e tardia em LBSap e

LEISHMUNE®, pode ser explicada por uma mobilização desta população que esta sendo recrutada, juntamente com neutrófilos, a migrarem seletivamente para o local do inóculo. Giunchetti (2007) ao avaliar o número de linfócitos observou redução em 15 dias após a primeira imunização em cães do grupo inoculado apenas com LB e SAPONINA em relação ao grupo controle. Além disto, Giunchetti (2007) observou no grupo LBSap aumento do número de linfócitos em relação ao grupo saponina no mesmo período. Neste sentido, as alterações hematológicas observadas persistem por até 15 dias após a vacinação. Estas alterações parecem ser fundamentais e devem implicar de forma direta na resposta local da região onde foi realizado o inóculo vacinal.

Neste contexto, o presente estudo buscou também avaliar a cinética de migração celular para a derme dos hamsters inoculados com as vacinas LBSap e LEISHMUNE® e seus constituintes vacinais (antígenos e adjuvantes) isoladamente. Após avaliar o percentual de células inflamatórias na derme, foi observado uma redução de neutrófilos durante o período tardio (168 horas) nos hamsters inoculados com LBSap, SAPONINA e LB comparado ao grupo SALINA. Por outro lado os animais que foram inoculados com a vacina LEISHMUNE®, apresentaram uma manutenção do percentual de neutrófilos na derme, demonstrando desta forma uma correlação positiva entre o percentual de neutrófilos no sangue periférico e na derme.

Estudos conduzidos em nosso laboratório por Vitoriano-Souza (2008) buscaram avaliar a cinética de migração celular em cães sensibilizados com diferentes vacinas e adjuvantes, incluindo, LBSap, SAPONINA e antígeno de L. braziliensis. Neste trabalho, foi verificado em diferentes compartimentos da derme um aumento de neutrófilos no período precoce no grupo SAPONINA. Estes resultados corroboram com os observados neste trabalho, uma vez que foi demonstrada uma tendência de aumento no percentual de

neutrófilos na derme de hamsters inoculados com SAPONINA no tempo precoce comparado ao tardio.

Tafuri (1992) e Tafuri et al. (1993) avaliaram as alterações histopatológicas da intradermoreação de Montenegro (TM) em cães através de uma cinética de reação (6, 12, 24, 48 e 72 horas, 7 e 14 dias) após a inoculação dos antígenos LEISHVACIN® e P10.000G. Neste estudo, foi observado que nas primeiras 24 horas após o inóculo, a reação inflamatória era composta de neutrófilos; após 48 e 72 horas, o infiltrado apresentou-se mais intenso e constituído, principalmente de células mononucleares (linfócitos e monócitos). Após 7 e 14 dias a reação tendia a ser menos intensa. Estes estudos corroboram com nossos resultados de cinética de migração celular, uma vez que observamos, aumento de neutrófilos no período precoce em relação ao tempo tardio.

Esses estudos confirmam o papel de neutrófilos como células importantes na primeira linha de defesa contra infecções (Ribeiro-Gomes et al., 2004), sugerindo mais recentemente sua participação na proteção induzida por vacinas. A invasão de patógenos induz os neutrófilos a deixarem a corrente sanguínea e migrarem para o sítio de infecção. Neste local, estas células são estimuladas a fagocitose, processamento e morte de patógenos por degranulação de compostos antimicrobianos e produção de radicais de oxigênio (Witko-Sarsat et al., 2000). Na maioria dos processos de inflamação aguda, os neutrófilos predominam no infiltrado inflamatório durante as primeiras 24 horas (Collins, 2000), respondendo a diversos estímulos e culminando em sua atividade microbicida. No presente estudo, mostramos a participação de neutrófilos na resposta imune inata após sensibilização com antígenos e adjuvantes vacinais.

Durante toda a cinética avaliada, não verificamos nenhuma alteração em relação ao percentual de eosinófilos na derme. Por outro lado, Vitoriano-Souza (2008) observou aumento de eosinófilos na derme de cães inoculados com SAPONINA e LBSap nos

tempos tardios, sugerindo que essas células, juntamente com os neutrófilos participariam efetivamente na resposta inata e no direcionamento da resposta específica no local do inóculo.

A infiltração de polimorfonucleares, principalmente dos neutrófilos para o foco inflamatório, é seguida pela migração de monócitos da corrente sanguínea para os tecidos, onde sofrem transformação em macrófagos. No presente estudo a análise de macrófagos na derme nos permitiu inferir que a SAPONINA promove um recrutamento precoce e persistente de monócitos. Além disto, os grupos vacinais (LBSap e LEISHMUNE®) apresentam uma manutenção desta população celular na derme. Este dado é altamente interessante, pois nos mostra que de alguma forma ocorre uma imunomodulação no processo de migração celular quando são adicionados antígenos de L. donovani e/ou L. braziliensis ao adjuvante saponina, como no caso das vacinas aqui testadas LEISHMUNE® e LBSap respectivamente. Estes antígenos associados ao adjuvante saponina parecem influenciar na queda da migração seletiva de monócitos para o local de imunização. Esta imunomodulação pode ser decorrente de ativação diferencial de algumas quimiocinas cuja ação não é quimioatraente para monócitos. Por outro lado, a administração isolada do adjuvante saponina recruta de forma marcante monócitos. Estas hipóteses precisam ser melhores investigadas e fazem parte de algumas perspectivas a serem alcançadas em breve por pesquisadores de nosso laboratório. O estudo de quimiocinas e citocinas e receptores do tipo Toll expressos no local da vacina é uma das etapas futuras que pretendemos cumprir para o entendimento destes eventos. Além disto, ainda pretendemos investigar a expressão de moléculas de adesão e de migração na superfície das células e do endotélio no microambiante que se forma no local do inóculo.

De forma interessante Vitoriano-Souza (2008), ao avaliar a cinética de macrófagos no local do inóculo de cães sensibilizados por diferentes antígenos vacinais observou uma

redução no percentual de macrófagos nos tempos iniciais nos grupos SAPONINA e LBSap.

Os macrófagos quando ativados produzem citocinas e várias delas agem de diferentes maneiras na evolução e resolução da resposta inflamatória, sendo importantes para o controle e modulação desta resposta. Os macrófagos desempenham importante papel na resposta imune, seja por atuarem como células apresentadoras de antígenos ou por produzirem e liberarem mediadores inflamatórios e quimiotáticos (Johnston, 1988; Laskin et al., 1994). Os macrófagos ativados via IFN-γ são capazes de gerar, IL-2, TNF-α, IL-12 e NO que aumentam a habilidade dessas células em controlar o desenvolvimento de patógenos (Brennan et al., 2004). A ativação representa um dos primeiros eventos na resistência inata à infecção intracelular. A interação de antígenos solúveis de Leishmania com suas moléculas de superfície assim como os parasitos fagocitados, são considerados mecanismos importantes no controle da resposta inflamatória e também do crescimento de parasitos.

No âmbito do recrutamento de linfócitos na derme observamos uma redução precoce (1hora) desta população celular no grupo LB em relação ao grupo SALINA com aumento tardio (96 e 168 horas) destas células no grupo LB, LBSap. Em uma análise de correlação foi possível detectar uma associação positiva entre linfócitos circulantes e linfócitos na derme de hamsters sensibilizados com LBSap.

Observamos que o grupo SAPONINA promoveu um recrutamento tardio (168 horas) de linfócitos em relação aos grupos SALINA e LEISHMUNE®. Além disto, a análise de correlação mostrou que o grupo LEISHMUNE® apresentou uma associação positiva entre linfócitos circulantes e os linfócitos da derme. Neste estudo, demonstramos que o adjuvante saponina contribui de forma marcante para o recrutamento de células apresentadoras de antígenos durante todo o período cinético avaliado com indução da

migração de linfócitos até mesmo no período tardio. O aumento de linfócitos no grupo SAPONINA e a redução desta população no período tardio após inoculação com LEISHMUNE® sugerem a modulação do infiltrado inflamatório pelo antígeno que compõe esta vacina (FML), um antígeno purificado de L. donovani, sendo este mais seletivo quanto à imunogenicidade devido a sua natureza antigênica (um antígeno protéico purificado). Por outro lado, o repertório antigênico da vacina LBSap é bem amplo compreendendo antígenos solúveis e fracionados de L. braziliensis que pode levar a um menor recrutamento seletivo de leucócitos circulantes em alguns dos momentos da cinética. De fato a vacina LBSap induz recrutamento tardio (168 horas) de linfócitos com envolvimento precoce de neutrófilos (12 horas). Por outro lado, Vitoriano-Souza, (2008) observou aumento de linfócitos em cães sensibilizados com saponina e LBSap no período tardio, sugerindo o papel deste adjuvante no recrutamento de linfócitos e deste modo ampliar e modular a resposta imune ainda no local do inóculo.

Em um estudo, que avaliou a cinética de migração celular no tecido subcutâneo de gatos após a administração de diferentes formulações vacinais contendo ou não adjuvantes mostraram um aumento da reação inflamatória bem como maior efetividade na reparação tecidual após administração de vacinas desprovidas de adjuvantes em sua composição (Day et al., 2007).

Os resultados obtidos através da sensibilização de hamsters em nosso trabalho demonstraram uma reação adversa (edema) muito discreta em alguns animais dos grupos sensibilizados com saponina e as vacinas LBSap e LEISHMUNE®, o que sugere uma inflamação local em resposta ao adjuvante saponina. De fato, nosso grupo de pesquisa publicou recentemente um estudo de imunogenicidade onde foram avaliados aspectos de toxicidade e inocuidade da vacina LBSap em cães (Giunchetti et al., 2007). Neste estudo, foi verificado que após a administração da vacina LBSap, alguns animais apresentaram

discretas alterações, que não comprometem a saúde dos animais como: edema e/ou nódulos circunscritos (Giunchetti et al., 2007). Outros estudos que avaliaram os aspectos da inocuidade e toxicidade da vacina LEISHMUNE® relataram a presença de reações transitórias induzidas pela saponina, tais como: dor local, anorexia, apatia, inchaço, vômito, alopecia, diarréia e reações alérgicas (prurido) em alguns animais imunizados. Todos estes eventos adversos em resposta a vacina LEISHMUNE® enriquecida com saponina desapareceram após uma segunda dose da vacina (Santos et al., 2007; Parra et al., 2007).

No presente estudo, realizamos uma abordagem direcionada a quantificação do infiltrado inflamatório através de morfometria por análise de imagem. A intensidade do infiltrado foi medida através da contagem de células no foco inflamatório pela análise morfométrica. Esta análise mostrou que os hamsters inoculados com SAPONINA e LEISHMUNE® apresentaram maior número de células no foco inflamatório no período tardio (48, 96 e 168 horas) e (96 e 168 horas), respectivamente. Ainda neste contexto, foi observado que o grupo sensibilizado com SAPONINA apresentou maior processo inflamatório em relação a SALINA e os animais inoculados com LEISHMUNE® em relação a SALINA e a vacina LBSap. Estes achados sugerem mais uma vez que a presença do adjuvante saponina poderia favorecer a migração celular para o local do inóculo, reforçando seu papel na formação do infiltrado inflamatório e sua aplicação como adjuvante vacinal. Diversos autores têm demonstrado o papel da saponina como adjuvante para modular a resposta imune mediada por células, realçar a produção de anticorpos assim como nas reações imunes não especificas como, no caso da inflamação aguda (Oda et al., 2000; de Oliveira et al., 2001; Haridas et al., 2001). A ausência de diferença significativa do infiltrado inflamatório observada na vacina LBSap, poderia indicar uma modulação do antígeno de L. braziliensis quando associado ao adjuvante saponina em induzir a migração

celular sem causar processo inflamatório exacerbado em praticamente todos os tempos da cinética.

A capacidade de um imunógeno em induzir a produção de óxido nítrico é considerada um fator fundamental, pois indica a capacidade de produção de citocinas do tipo 1, fundamentais no estabelecimento de uma resposta imune contra patógenos intracelulares. Neste sentido, a produção de NO pela iNOS possibilita a manutenção da atividade antimicrobiana de macrófagos ativados contra uma variedade de patógenos intracelulares (Rivera et al., 2002). Brandonísio et al. (2001) associaram um perfil de proteção na leishmaniose que foi caracterizado pela maior expressão de iNOS e a maiores níveis de NO. Desta forma no foco inflamatório, os macrófagos são ativados e expressam iNOS, levando a altos níveis de produção de NO, podendo atuar em mecanismos efetores em resposta a patógenos intracelulares. Nos últimos anos, alguns autores demonstraram que a ativação do sistema imune e o estabelecimento de um perfil de caráter inflamatório estão geralmente associados ao aumento da expressão de iNOS (Panaro et al., 2001; Rivera et al., 2002). No presente trabalho não observamos nenhuma diferença significativa entre

os grupos em relação à área marcada para iNOS. Por outro lado, foi observada uma tendência de maior área marcada para iNOS no grupo SAPONINA e este aumento foi correlacionado positivamente à resposta inflamatória apresentada por este grupo. Assim, é possível hipotetizar que uma maior expressão de iNOS pelos neutrófilos e macrófagos no grupo SAPONINA esteja ocorrendo devido ao maior recrutamento destas células para a derme e após ativação seriam capazes de induzir um microambiente caracterizado por um perfil de citocinas do tipo 1 (como IFN-γ) resultando na produção de NO.

Quanto ao grupo LB, foi observado correlação positiva entre o número de linfócitos na derme e a expressão de iNOS, ao passo que foi demonstrado correlação negativa entre