Vedlegg 2: Metodeproblemer

O processo de expansão geográfica e urbanização da LV no Brasil chamam a atenção para a necessidade de aprimoramento de medidas mais eficazes de controle e profilaxia. As atuais medidas de controle da LV preconizam o tratamento dos casos humanos, combate ao vetor e eutanásia dos cães com LV. No entanto, a dificuldade de se realizar a eutanásia nestes animais, associada ao tratamento da LVC nos centros urbanos, põe em risco os programas de controle da LV, e a saúde da população humana. Neste contexto, considerando que a quimioterapia na LVC ainda não proporciona cura parasitológica, o desenvolvimento de vacinas anti-LVC seria a melhor alternativa para os programas de controle da LV. Também, considerando a importância da imunoprofilaxia contra LVC, surge a necessidade de novas metodologias que incremente a avaliação de candidatos vacinais, na triagem de imunobiológicos que sejam efetivos contra o agente etiológico da LV. Além disto, até o momento, não havia estudos que buscassem o entendimento de eventos celulares no local do inóculo dos antígenos vacinais. Tais eventos são importantes no entendimento de mecanismos imunomodulatórios pós-vacinais que direcionam a resposta imune e coordenam a imunogenicidade das vacinas, além de serem fundamentais nas avaliações das alterações locais advindas do processo vacinal. Neste contexto, no presente estudo foi avaliada a cinética da migração celular, um dos principais eventos que caracterizam o processo inflamatório induzido pelo inóculo de antígenos e adjuvantes de duas vacinas (LEISHMUNE® e LBSap).

3.1 - Objetivo Geral

¾ Avaliar a cinética da migração celular e os níveis de óxido nítrico após inóculo de duas vacinas anti-LVC: LEISHMUNE® e LBSap bem como do adjuvante saponina e do antígeno vacinal de L. braziliensis isoladamente nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas.

3.2 - Objetivos Específicos

Avaliar inóculos intradérmicos em hamsters inoculados com as vacinas LEISHMUNE® e LBSap, bem como por seus diferentes componentes vacinais nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas, considerando os parâmetros abaixo listados:

¾ Quantificar o percentual das populações de polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos) e de mononucleares (linfócitos e monócitos) em esfregaços sanguíneos e em cortes histológicos da derme;

¾ Quantificar os níveis séricos de óxido nítrico;

¾ Quantificar a intensidade da reação inflamatória em cortes histológicos da derme; ¾ Quantificar a expressão da enzima iNOS no infiltrado inflamatório da derme.

4.1- Animais

No presente trabalho foi traçado um delineamento experimental utilizando 120 hamsters sírios dourados (Mesocricetus auratus), sendo 72 machos e 48 fêmeas com um peso corporal médio de 120 gramas e idade de oito semanas. Os animais foram gentilmente cedidos pelo biotério de criação de animais de experimentação do Instituto de Pesquisas René Rachou-/FIOCRUZ/MG e mantidos no Biotério de experimentação da Universidade Federal de Ouro Preto durante a realização dos experimentos. Os animais foram mantidos em temperatura entre 21 a 24°C, e alojados em gaiolas apropriadas para esta espécie, forradas com serragem sendo oferecidos água e ração comercial ad libitum diariamente. A Figura 01 ilustra, de forma esquemática, o delineamento experimental utilizado neste trabalho.

Figura 1 - Delineamento experimental

(*) Hamsters por tempo (horas): n = 4

120 hamsters Mesocricetus auratus

LB n=24 SALINA n=24 SAPONINA n=24 LBSap n=24 LEISHMUNE® n=24 Punção Intracardíaca Esfregaço Contagem Diferencial NO Sérico Pele Necropsia Histopatologia (HE) PMN Neutrófilo Eosinófilo Mononucleares Linfócito e Monócito 1 12 24 48 96 168 Horas* Imuno- histoquímica (iNOS) Contagem Diferencial

120 hamsters Mesocricetus auratus

LB n=24 SALINA n=24 SAPONINA n=24 LBSap n=24 LEISHMUNE® n=24 Punção Intracardíaca Esfregaço Contagem Diferencial NO Sérico Pele Necropsia Histopatologia (HE) PMN Neutrófilo Eosinófilo Mononucleares Linfócito e Monócito 1 12 24 48 96 168 Horas* Imuno- histoquímica (iNOS) Contagem Diferencial

4.2 - Grupos experimentais

Os animais foram subdivididos em cinco grupos experimentais:

(i) GRUPO SALINA - Animais que receberam inóculo de solução salina estéril 0,85% (diluente dos componentes vacinais e adjuvantes);

(ii) GRUPO SAPONINA - Animais que receberam inóculo de 100 µg do adjuvante saponina (Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A.);

(iii) GRUPO LB - Animais que receberam inóculo composto de 60 µg do antígeno vacinal de L. braziliensis;

(iv) GRUPO LBSap - Animais que receberam 60 µg de antígeno de L. braziliensis (LB) associado a 100 µg de saponina;

(v) GRUPO LEISHMUNE® - A LEISHMUNE® foi reconstituída em 2 mL com solução salina estéril 0,85% e inoculada nos animais na quantidade de 200 µL contendo 150 µg de antígeno FML associado a 100 µg de saponina.

É importante ressaltar que os diferentes inóculos foram diluídos em solução salina estéril 0,85% e aplicados nos diferentes grupos um volume total de 200 µL.

4.3 - Antígenos vacinais e aplicação dos inóculos

Foram avaliados os tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas pós inóculo para cada estímulo avaliado (Figura 1). Para melhor compreensão dos resultados foi denominado de período precoce os tempos de 1, 12 e 24 horas e de período tardio os tempos de 48, 96 e 168 horas, durante os diferentes períodos avaliados.

Foi usado o imunobiológico preparado a partir de antígeno de L. braziliensis (cepa padrão – MHOM/BR/75/M2903) acrescido do adjuvante saponina, recentemente patenteado pela UFOP em parceria com o Instituto René Rachou/FIOCRUZ/MG (PI0601225-6, 17 de Fevereiro de 2006).

Também foi usada a vacina FML, de nome comercial LEISHMUNE®, desenvolvida pela Dra Clarissa Palatnik e colaboradores da UFRJ e atualmente comercializada pela Fort Dodge (Campinas- SP/ Brasil). A vacina foi gentilmente cedida pela Fort Dodge para o desenvolvimento deste trabalho.

Os antígenos foram inoculados na região abdominal dos hamsters. Os inóculos foram realizados através de injeções intradérmicas e após o procedimento, o local do inóculo foi demarcado com caneta (Sigma) para delimitar a área de biópsia.

4.4 - Coleta das amostras

Previamente ao procedimento da necrópsia dos animais para obtenção dos fragmentos de tecidos, foi coletado sangue por punção intracardíaca com seringas plásticas estéreis, descartáveis de 1 mL. A coleta foi realizada após administração de anestésico (tiopental sódico) na dose de 30 mg/kg via intraperitoneal. Foi coletado um volume aproximado de 1ml de sangue sendo que uma pequena alíquota foi retirada para a realização dos esfregaços para contagem diferencial das populações de polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos) e mononucleares (monócitos e linfócitos) e o restante então transferido para eppendorf de 1,5 mL (Hamburgo, Alemanha). O sangue foi então centrifugado a 1.500 rpm e o soro separado. As amostras foram devidamente identificadas e estocadas a -70°C até o processamento para avaliação dos níveis de NO sérico.

4.5 - Necropsia dos animais e obtenção do material biológico

Os hamsters submetidos aos diferentes inóculos foram necropsiados nos tempos de 1, 12, 24, 48, 96 e 168 horas após eutanásia com tiopental sódico. Confirmada a morte, os animais foram colocados em decúbito dorsal e a cavidade abdominal aberta com auxílio de uma tesoura cirúrgica. Fragmentos de pele da área inoculada com os antígenos e salina e fragmentos de pele da área sem nenhum estímulo, foram coletados e em seguida fixados

em formol a 10% tamponado (pH 7,2). Fragmentos foram também retirados e embebidos em OCT (Optimal Cutting Temperature Médium, Tissue Tek Leica Microsystem Nussloch Gmbh Wehrheim, Germany) e armazenados no -70ºC para realização de trabalhos futuros.

4.6 - Processamento histológico dos tecidos e colorações empregadas

Fragmentos de pele submetidos aos diferentes inóculos e fragmentos não submetidos ao inóculo e fixados em formol 10% tamponado pH 7,2 foram processados rotineiramente e embebidos em parafina. Sobre lâminas de vidro, previamente gelatinizadas, foram colocados cortes histológicos com espessura de cinco µm. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas de controle de qualidade do laboratório.

Das duas lâminas obtidas, a primeira foi corada pelo método de Hematoxilina- Eosina (HE) para análise rotineira das alterações histopatológicas e a segunda, foi utilizada para realização da reação imuno-histoquímica para detecção da expressão de iNOS.

4.7 - Imuno-histoquímica para a detecção da expressão de iNOS

Os cortes histológicos da pele, obtidos por microtomia foram inicialmente desparafinizados em duas lavagens de xilol (15 minutos cada) e hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e finalmente em água corrente por cinco minutos. Posteriormente, foram mergulhados em uma solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) a 4% em metanol por 30 minutos para o bloqueio da peroxidase endógena. Seguiram-se três lavagens em PBS (cinco minutos cada). A recuperação antigênica foi feita utilizando 15 mL de uma solução recuperadora antigênica (Antigen Unmasking Solution: H-3300; Vector Laboratories Inc; Burlingame, CA, USA) diluída em 1,6 L de água. As secções foram então colocadas em uma panela de pressão de microondas

imersas na solução e levadas ao forno de microondas por 13 minutos com a panela semi- aberta e em seguida foram retiradas e com a panela fechada voltava para o forno por mais 10 minutos, com a intenção de promover a recuperação dos sítios antigênicos, intensificando assim a marcação imuno-histoquímica. Após esta etapa, as lâminas foram deixadas a temperatura ambiente, por 30 minutos, ainda imersas na solução seguido por três lavagens em PBS (cinco minutos cada).

Para o bloqueio de sítios antigênicos inespecíficos foi utilizado o soro de cavalo (Kit Vector RTU- Universal Elite ABC KIT, Burlingame, CA, USA) e em seguida incubado em câmera úmida na estufa a 37°C por 30 minutos. Foi utilizado o anticorpo primário policlonal IgG de coelho anti-iNOS (Rabbit anti-Mouse iNOS, SC-651, Santa Cruz, CA, USA) na diluição 1:200, ficando as lâminas incubadas por 12 a 18 horas a 4ºC em câmara úmida.

Após a incubação com o anticorpo primário as lâminas foram colocadas a temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, ocorreram à lavagem em PBS, procedendo três banhos de cinco minutos cada. As lâminas foram então incubadas com o anticorpo biotinilado (Kit Vector RTU- Universal Elite ABC KIT, CA USA) por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação com o anticorpo biotinilado (RTU- Universal Elite ABC KIT, CA, USA) realizou-se a lavagem dos cortes com três banhos de PBS de cinco minutos cada. Posteriormente ocorreu a incubação com o complexo ABC (Kit vector RTU- Universal Elite ABC KIT, CA, USA) por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação com o complexo avidina-biotina, foi realizada a lavagem dos cortes em PBS, através de três banhos de cinco minutos cada.

A reação foi revelada mergulhando-se os cortes em uma solução de DAB (50 mg de Diaminobenzidina em 250 mL de PBS e 500 µL de Peróxido de Hidrogênio 30%) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Após a revelação, os cortes foram lavados em

água corrente. Para realizar a contra-coloração, utilizou-se Hematoxilina de Harris por 10 segundos a temperatura ambiente, seguido pela lavagem dos cortes por 5 minutos em água corrente. O material foi então desidratado em álcool absoluto e colocado para secar em estufa a 56°C. As lâminas foram montadas com Entellan (Merk 107961.0100 - Darmstadt, Alemanha) e lamínula para a posterior avaliação. Estes procedimentos operacionais são padrões do laboratório de imunopatologia do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB/UFOP), seguindo as normas do controle de qualidade deste laboratório.

4.8 - Quantificação da inflamação na derme

As células inflamatórias presentes na derme foram quantificadas em 20 imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2). As imagens visualizadas pela objetiva de 40x foram digitalizadas através da microcâmera Leica DM5000B e do programa Leica Application Suite (Versão 2.4.0 R1 Leica Microsystems-Switzerland Ltd). Para a análise das imagens obtidas foi utilizado o programa Leica QWin V3 (Leica Microsystems-Switzerland Ltd). A escolha pela análise em 20 imagens foi devido a um estudo piloto no laboratório, onde foi demonstrado que esse número de campos era suficiente para a obtenção de uma leitura representativa da lâmina inteira.

4.9 - Análise quantitativa da expressão de iNOS

Estudos morfométricos da expressão de iNOS foram realizados através da análise de imagem (obtidas por uma microcâmera Leica DM5000B e analisadas pelo programa Leica QWin V3) pela medida da área marcada para iNOS em 20 imagens aleatórias (área total percorrida igual a 1,5 x 106 µm2) na derme. Todas as análises foram realizadas nas imagens digitalizadas na objetiva de 40x.

4.9.1 - Contagem Diferencial: leucócitos circulantes e células teciduais

A contagem diferencial de leucócitos circulantes foi realizada nos esfregaços sangüíneos, corados por método panótico, e de células inflamatórias teciduais nos cortes histológicos corados pela hematoxilina e eosina, sendo ambas examinadas em microscopia óptica através de imersão em óleo utilizando a objetiva de 100X. Para a contagem das populações celulares em lâmina foram avaliadas 100 células em campos aleatórios, diferenciando-se os seguintes tipos celulares: polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos) e mononucleares (monócitos e linfócitos), sendo encontrado, assim, o percentual de cada tipo celular.

4.9.2 - Avaliação do perfil de Óxido Nítrico

A avaliação das concentrações de NO foi realizada pela medida de nitritos (NO2-) e nitratos (NO3-) segundo o método de Green et al. (1982) nos soros de hamsters submetidos aos diferentes inóculos.

As amostras foram descongeladas e alíquotas de 50 µL foram transferidas para eppendorfs de 500 µL e diluídas em 50 µL de água destilada. Para a conversão de nitratos a

nitritos, foram adicionados às amostras 30 µL de um coquetel contendo 10 µL de FAD (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA), 10 µL de NADPH (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA) e 10 µL de Nitrato redutase (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA) a qual tem uma concentração de 1 U/mL (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA). As amostras foram incubadas 12 a 18 horas a 37ºC.

Após este período, foi realizada a desproteinização através da adição de 10 µL de sulfato de zinco (ZnSO4) (Sigma- Aldrich Co St. Louis, MO, USA), seguido por cinco minutos de centrifugação a 5.000 rpm. Após esta etapa, foram adicionadas as placas de 96 orifícios, 50 µL das amostras preparadas e 50µL do reagente de Griess, em duplicata, e incubados em uma caixa de isopor a temperatura ambiente por 10 minutos. O reagente foi

preparado na hora do uso, misturando partes iguais de duas soluções A e B na proporção de 1:1. Sendo a solução A de Sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% e a solução B de Naftilenodiamino 0,7%.

Após a reação, foi determinada a absorbância a 540 nm em leitor de ELISA (Molecular Devices, E Max, Berkeley, Califórnia, USA). Os resultados expressos em µM foram determinados após a extrapolação de valores obtidos de uma curva padrão utilizando nitrito de sódio (NaNO2) nas concentrações de 0,78 a 100 µM para cada placa.

4.10 - Análises Estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas usando o GraphPad Prism 4.0 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Depois de demonstrada a normalidade dos dados usando o teste Kolmogorov-Smirnoff, foi realizada análise de variância (ANOVA one-way) seguida do teste de Tukey para determinar as diferenças específicas entre os grupos em relação ao infiltrado celular na derme e contagem diferencial no sangue periférico. Além disto, foram realizadas correlações entre leucócitos circulantes ou entre iNOS e infiltrado celular na derme pela análise de correlação de Pearson. Em todas as análises estatísticas as diferenças foram consideradas significativas quando o valor de P foi menor que 0,05.