DEL 1 KUNSTINSTITUSJONELLE KONTEKSTER
3 DEN PROFESJONELLE KUNSTVERDEN
3.3. V ERDIKJEDEN I DEN PROFESJONELLE KUNSTVERDEN
A detecção inicial de atividade antimicrobiana na fração rica da espata de Z. aethiopica forneceu evidências suficientes para que instigar uma busca por AMPs nos dados gerados a partir do transcriptoma da espata. Quase todas as famílias de AMPs de plantas são ricas em cisteínas e possuem uma estrutura globular estabilizada por pontes dissulfeto (S-S). Já foram descritas em órgãos florais defensinas, proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs), heveínas, ciclotídeos e snakinas (TAKECHI et al., 1999; TAVARES et al., 2008; NGUYEN et al., 2011).
Neste estudo, foi possível identificar através de análise de mineração de dados (data mining), três classes de AMPs de flores. Seguindo os parâmetros estabelecidos, foi possível distinguir 34 sequências contendo os padrões de AMPs supracitados. Dentre essas 34 sequências, 15 apresentaram peptídeo sinal e não apresentaram domínio transmembrana após análise através do programa Phobius, predizendo uma possível secreção da molécula pela célula. Contudo, apenas dez sequências apresentaram um domínio de AMP, de acordo com análise através do InterPro Scan. Ao utilizar esta ferramenta foi possível identificar seis LTPs, três snakinas/GASA e uma quimerolectina contendo um domínio heveína, as quais podem ser consideradas potenciais AMPs. Finamente, apenas as três potenciais LTPs apresentaram predição positiva para AMPs segundo o programa CS-AMPPred, e foram aqui identificadas como Za-AMP1, Za-AMP2 e Za-AMP3. Os padrões ricos em cisteínas propostos por
Silverstein e colaboradores (2007) para LTPs não são restritivos, e abrangem também as albuminas 2S e as proteínas ECA1 (calcium transport ATPase 1). Por essa razão, foram construídos modelos estruturais para confirmar a caracterização das LTPs encontradas. Os modelos moleculares indicaram que as três LTPs preditas possuem um enovelamento típico de LTPs, apresentando quatro hélices empacotadas, estabilizadas por quatro pontes dissulfeto (os parâmetros de validação estão na Tabela 7).
Tabela 7: Sumário de validação dos parâmetros dos modelos tridimensionais das LTPs*.
Peptídeo Modelo Dope Score
Gráfico de Ramachandran
G-Factor (PROSA II) Z-Score Regiões mais
favorecidas (%) permitidas (%) Regiões
Za-LTP1 1FK5 -9204,11816 85,2 12,3 0,06 -4,34 Za-LTP2 2LJO -9223,97461 85,6 8,9 -0,03 -4,35 Za-LTP3 2LJO -7205,93848 70,4 27,2 -0,10 -4,26 *LTPs: Proteínas transportadoras de lipídeos
Desta forma, foi realizada uma busca para verificação da capacidade das LTPs em interagirem com lipídeos. Utilizando-se o servidor COFACTOR, foi possível predizer um lipídeo para cada modelo de LTP (Tabela 8 e Figura 9).
Tabela 8:Scores finais para o processo de acoplamento (docking) através de dinâmica molecular para as proteínas
transportadoras de lipídeos (LTPs) de Z. aethiopica e seus ligantes lipídicos.
LTP* Ligante COFACTOR BS-Score Hit no PDB RMSD (Å)Dinâmica Molecularb TM-Score a
Za-LTP1 Ácido Linoleico (OLA) 1.54 1FK5 3.16 0.69 Za-LTP2 Ácido Palmitoleico (PAM) 1.62 1UVB 3.55 0.68 Za-LTP3 Ácido alfa-Linoleico (LNL) 1.01 1FK6 10.79c 0.50
aDados gerados por comparação da estrutura em 0ns e 50ns. bA evolução de RMSD durante o tempo está disponível na Figura 9. cExcluindo a cauda de poliprolina, este valor é reduzido a 4.117.
Figura 9: Avaliação das simulações de dinâmica molecular dos complexos proteína-lipídeo através de
RMSD. A. Za-LTP1 + ácido linoleico; B. Za-LTP2 + ácido palmitoleico e C. Za-LTP3 + ácido alfa- linoleico. Tempo (ps) Tempo (ps) Tempo (ps) R MSD (n m) R MSD (n m) R MSD (n m)
Figura 10: Análise estrutural das proteínas transportadoras de lipídeos. A. Alinhamento múltiplo das LTPs
identificadas neste estudo. Resíduos de aminoácidos conservados foram destacados em azul e os resíduos de cisteínas foram destacados em amarelo. As estruturas tridimensionais finais das LTPs com seus respectivos ligantes (0ns e 50ns de dinâmica molecular) foram ilustradas em B. Za-LTP1 + ácido oleico 0ns; C. Za-LTP1 + ácido oleico 50ns; D. Za-LTP2 + ácido palmitoleico 0ns; E. Za-LTP2 + ácido palmitoleico 50ns; F. Za- LTP3 + ácido alfa-linoleico 0ns e G. Za-LTP3 + ácido alfa-linoleico 50ns.
A Figura 10 ilustra os modelos de LTPs e seus respectivos ligantes: Za-LTP1 e ácido linoleico (OLA) (Figura 6.B e 6.C), Za-LTP2 e ácido palmitoleico (PAM) (Figura 10.D e 10.E), e Za-LTP3 e ácido alfa-linoleico (LNL) (Figura 10.F e 10.G).
Um alinhamento múltiplo de sequências (Figura 10.A) foi realizado com o intuito de se destacar o padrão conservado de cisteínas entre as três LTPs estudas. A estabilidade do complexo foi avaliada através de dinâmica molecular, onde foi observada a afinidade entre as LTPs e as moléculas lipídicas durante 50 ns de simulação. Os valores de RMSD (root-mean- square deviation) e TM-Score (template-modeling score) apresentados na Tabela 8 indicaram que o enovelamento estrutural das LTPs se manteve estável. O método de mineração de dados aplicado à busca in silico por AMPs no transcriptoma de Z. aethiopica demonstrou que as três LTPs (Za-LTP1, Za-LTP2 e Za-LTP3) encontradas podem ser consideradas candidatos confiáveis à moléculas antimicrobianas.
As LTPs fazem parte de uma família multigênica e podem ser expressas em diversos órgãos da planta, sendo temporal e espacialmente reguladas. As mesmas estão envolvidas em uma grande quantidade de processos biológicos como biossíntese de cutina, desenvolvimento da antera e defesa (CHEN et al., 2011). Entre suas funções, as LTPs podem atuar aumentando a taxa de transferência de lipídeos intermembranas, característica que tem sido utilizada em estudos de entrega e transferência de drogas (PIETERSE et al., 2001). Na Tabela 9 é possível visualizar as interações moleculares observadas nos complexos LTP – lipídeo que foram descritos neste trabalho. Foram descritas interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio entre os átomos das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos exposto no centro do peptídeo e o esqueleto carbônico do lipídeo específico para cada complexo.
Tabela 9: Interações moleculares observadas nos complexos LTP-lipídeo discutidos neste trabalho. Aminoácido Za-LTP1 - OLAa Tipo de interação molecular Za-LTP2 - PAMb Za-LTP3 - LNLc
LEU – 43 --- --- Hidrofóbica
LEU – 60 --- --- Hidrofóbica + ponte de
hidrogênio
ASN – 86 --- --- Hidrofóbica
ASP – 90 --- --- Hidrofóbica
MET – 15 --- Hidrofóbica ---
TYR – 83 --- Ponte de hidrogênio ---
LEU – 13 Hidrofóbica --- ---
CYS – 16 Hidrofóbica --- ---
VAL – 35 Hidrofóbica --- ---
ASN – 39 Ponte de hidrogênio --- ---
LYS – 62 Hidrofóbica --- ---
ILE – 89 Hidrofóbica --- ---
Na Figura 11 é possível observar esquematicamente a distribuição espacial das interações observadas.
Figura 11: Interações moleculares observadas entre os resíduos de aminoácidos das LTPs identificadas
no transcriptoma de Z. aethiopica. A. Za-LTP1 + OLA (acido oleico); B. Za-LTP2 + PAM (ácido palmitoleico) e C. Za-LTP3 + LNL (ácido alfa-linoleico). Todas as interações mantiveram-se no limite de distância de 3.6 Å.
Tem-se observado que os complexos LTP – lipídeo podem reconhecer receptores de membrana envolvidos nas vias de respostas de defesa locais (PIETERSE et al., 2001). Esses peptídeos têm sido amplamente estudados devido ao seu potencial antimicrobiano, como as LTPs não-específicas de folhas de cevada, espinafre e Arabidopsis que são capazes de inibir o crescimento das bactérias C. michiganensis, P. solanacearum e do fungo F. solani (MOLINA et al., 1993; SEGURA et al., 1993).
O ácido oleico observado no complexo com a Za-LTP1 (Figura 10B e 10C; Figura 11A) consiste em um ácido graxo carboxílico de cadeia longa essencial, monoinsaturado e possui 18 carbonos em sua estrutura (18:1 cis-9 – ômega 9) (GE et al, 2003). Assim como o ácido oleico, o ácido alfa linoleico observado no complexo com a Za-LTP3 (Figura 10F e 10G e Figura 11C) é também um ácido graxo carboxílico de cadeia longa, e apresenta 18 carbonos em sua estrutura (18:2 cis-9, 12 – ômega 6), contudo apresenta duas insaturações entre seus carbonos. Em nossos ensaios antibacterianos, a fração rica em proteína de Z. aethiopica não foi capaz de inibir o crescimento de S. aureus. Considerando-se a informação de que essa bactéria é capaz de utilizar os ácidos oleico e alfa-linoleico como fontes de carbono, e a hipótese de que as LTPs identificadas no transcriptoma da planta estejam sendo expressas de forma basal; esses peptídeos poderiam estar atuando a favor do micro- organismo, uma vez que os lipídeos mantêm uma interação estável dentro do complexo LTP – lipídeo. Eventualmente, a proteína ancorada na parede celular presente em S. aureus não permitiria a ação antibacteriana do complexo, o que poderia justificar a não inibição do crescimento desta bactéria.
E. coli, por sua vez, possui uma das composições fosfolipídicas estruturais de membrana mais simples na natureza, possuindo apenas três fosfolipídeos com apenas três cadeias lipídicas diferentes. A composição lipídica da membrana contém ácido palmítico (saturado), ácido palmitoleico e ácido cis-vacênico (insaturados) (RAHNAMAEIAN, 2011). O ácido palmitoleico é um ácido graxo monoinsaturado e possui 16 carbonos em sua estrutura (16:1 cis-9, ômega 7). Neste trabalho, o ácido palmitoleico foi utilizado para formação do complexo com Za-LTP2 (Figura 10D e 10E e Figura 11B). É possível que este complexo atue sobre a membrana de E. coli, dada a alta taxa de inibição do crescimento desta bactéria observada nos ensaios antibacterianos em caldo. Contudo, são necessários experimentos in vitro adicionais para confirmação das hipóteses levantadas acerca da atuação dos complexos LTP – lipídeos um vez que outros compostos não aqui observados também constituem o tecido floral.
5 CONCLUSÃO
Neste estudo a tecnologia de RNA-Seq foi aplicada para a investigação do transcriptoma global da espata de planta adulta de Z. aethiopica na ausência de estímulo abiótico ou biótico. Os dados obtidos através desta tecnologia demonstraram que a técnica foi eficiente na caracterização do transcriptoma desta planta não-modelo. Através da construção do perfil funcional deste organismo, foi possível verificar o alto nível de investimento da planta destinado à informações genéticas e processos transcricionais relacionados ao metabolismo. Além disso, o investimento em transcritos relacionados ao metabolismo de carboidratos, aminoácidos e metabólitos secundários demonstraram ser priorizados. Esses eventos podem indicar um investimento do organismo na manutenção da homeostase, uma vez que existe uma clara interação entre os sistemas circadianos, de sinalização hormonal e imunidade basal. Essa comunicação entre os sistemas proporciona um impressionante potencial regulatório em prol da ativação dos múltiplos mecanismos de resistência, e podem auxiliar a planta a coordenar a ativação de um sistema específico em detrimento de outro, permitindo desse modo, a manutenção de um sistema ótimo de defesa contra patógenos e predadores. Ademais, a análise do transcriptoma de Z. aethiopica nos ofereceu informações valiosas acerca desta planta, possibilitando novas percepções em relação à fisiologia vegetal e seus mecanismos moleculares. As análises proteômicas deverão ser utilizadas para confrontar os dados obtidos através do perfil transcriptômico, permitindo a construção de um cenário funcional mais coeso. Finalmente, a atividade antibacteriana observada para o extrato de Z. aethiopica pode estar associada ao alto teor de metabólitos secundários que foram distinguidos no perfil funcional e, adicionalmente, as LTPs aqui identificadas podem desempenhar um papel crucial na defesa primária desta planta, contudo não se pode afirmar sua atividade antimicrobiana na ausência de testes mais profundos.
6 PERSPECTIVAS
Os estudos transcriptômicos nos abrem um leque de oportunidades de estudos sobre um determinado organismo. A utilização da tecnologia de sequenciamento de nova geração para estudos de organismos não-modelo é relativamente recente, e surge como uma excelente alternativa na pesquisa de espécies desprovidas de informações genômicas completas e acuradas.
Neste trabalho foi possível traçar o perfil transcriptômico da planta Z. aethiopica, através da montagem de novo dos transcritos obtidos por meio de RNA-Seq. Entretanto, o grande volume de informações gerado por essa tecnologia nos permite explorar futuramente os dados sob outras óticas para ampliação dos conhecimentos desta espécie.
Adicionalmente, foram prospectados dentro do conjunto de dados deste transcriptoma, peptídeos com potencial antimicrobiano, dentre os quais foram identificadas três LTPs. Estas moléculas, aqui caracterizadas in silico, necessitam de testes in vitro para confirmação de sua atividade antibacteriana e possível utilização no desenvolvimento de drogas.
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