Den politiske avhengighetens problem – Offentlige tilskudd

Nos testes de transferibilidade realizados, os locos Tau07, Tau08, Tau09, Tau10, Tau13, Tau14, Tau19, Tau20, Tau23 e Tau30 não amplificaram nas espécies e temperaturas testadas. Apenas seis e nove pares de primers amplificaram em Tabebuia chrysotricha e T.

roseo-alba respectivamente.

A maioria dos locos apresentou amplificação em temperatura inferior àquela para qual foi desenvolvido, especialmente em T. chrysotricha (Tabela 2). Nenhum primer mostrou indícios de bandas inespecíficas na quantificação da PCR em gel de agarose 3% na temperatura escolhida.

Tabela 2: Temperatura de anelamento na transferibilidade de primers microssatélites de Tabebuia aurea para T.

chrysotricha (TC) e T. roseo-alba (TR). Locos TC TR Tau12 50°C 50°C Tau15 52°C Na Tau16 Na 56°C Tau17 48°C 50°C Tau18 Na 56°C Tau21 Na 56°C Tau22 52°C 56°C Tau24 54°C Na Tau27 Na 56°C Tau28 56°C 56°C Tau31 Na 56°C

Na - Não amplificou nas temperaturas testadas.

Após a genotipagem, o loco Tau24 para T. chrysotricha e os locos Tau12, Tau16 e Tau17 para T. roseo-alba foram descartados devido ao grande número de falhas (maior que 70%). Resultando em um número total de locos efetivamente transferidos de cinco para T.

chrysotricha e seis para T. roseo-alba. A descrição dos locos foi feita com base em todos os

indivíduos genotipados (Tabela 3).

A maioria dos locos apresentou uma amplitude de alelos maior nas espécies estudadas (principalmente em T. crhysotricha) do que em T. aurea, espécie para a qual foram desenvolvidos (BRAGA, 2006). Entretanto, os intervalos de número de pares de bases se sobrepõem, ao menos em parte, nas três espécies, com exceção do loco Tau17.

26 Todos os locos utilizados mostraram-se polimórficos e em equilíbrio de ligação nas duas espécies, com exceção dos locos Tau17 e Tau22 que se mostraram em desequilíbrio de ligação em T. chrysotricha (Tabela 4 e Tabela 5).

Tabela 3: Caracterização dos locos microssatélites desenvolvidos para Tabebuia aurea (TA) (Braga, 2006) e

utilizados para genotipagem de T. chrysotricha (TC) e Tabebuia roseo-alba (TR).

Loco SSR Amplitude dos alelos (pb) Temperatura de anelamento

Tau12 146-212 _160-230 TA TC 56ºC TA 50ºC TC Tau15 104-166 _102-166 TA TC 56ºC TA 52ºC TC Tau17 _106-120 148-240 TA TC 56ºC TA 48ºC TC Tau18 _138-276 180-256 TA TR 56ºC TA; TR Tau21 198-290 _164-246 TA TR 56ºC TA; TR Tau22 132-166 TA 110-212 TC 122-154 TR 56ºC TA; TR 52ºC TC Tau27 146-200 _108-286 TA TR 56ºC TA; TR Tau28 140-190 TA 108-184 TC 128-258 TR 56ºC TA;TC 54ºC TR Tau31 210-270 _108-272 TA TR 56ºC TA; TR

Tabela 4: Caracterização dos locos utilizados em Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba.

Espécie Locos N A Ho He Fis p Tabebuia crhysotricha Tau12 38 7 0,7900 0,702 -0,125 0,9310 Tau15 52 12 0,5580 0,844 0,339 0,0002 Tau17 59 6 0,7960 0,604 -0,318 0,9998 Tau22 58 16 0,8960 0,742 -0,208 10,0000 Tau28 55 10 0,5820 0,530 -0,098 0,8838 Todos 52,40 10,20 0,7240 0,684 -0,059 0,9456 Tabebuia roseo-alba Tau18 34 12 0,1474 0,801 0,816 _0,0002 Tau21 32 15 0,8127 0,895 0,092 0,1113 Tau22 36 9 0,7497 0,743 -0,009 _0,6123 Tau27 31 20 0,5803 0,933 0,378 0,0002 Tau28 28 15 0,4994 0,870 0,426 _0,0002 Tau31 29 12 0,8621 0,857 -0,006 0,6107 Todos 31,67 13,83 0,6090 0,850 0,284 0,0002

N - Número de indivíduo analisados por loco; A - Número de alelos por loco; He – Heterozigosidade esperada sob equilíbrio de Hardy-Weinberg; Ho - Heterozigosidade observada; Fis - índice de fixação; p – valores de p para o Fis - realizado com FSTAT

baseado em 5.000 permutações com p-valor corrigido (Bonferroni - nível nominal de 5%) igual a 0,01000 para T. chrysotricha e 6.000 permutações e p-valor corrigido de 0,00833 para T. roseo-alba.

27 O número médio de alelos por loco foi menor em T. chrysotricha (10,20) do que em T.

roseo-alba (13,83), variando de 6 (Tau17) a 16 (Tau22) em T. chrysotricha e de 9 (Tau22) a

20 (Tau27) em T. roseo-alba.

A distribuição das frequências alélicas mostra que a maioria dos locos (50% a 81% dos alelos de cada loco) apresenta frequência inferior a 0,05, sendo que a menor e a maior frequência alélica encontrada foi de 0,008 (Tau17) e 0,645 (Tau28) para T. chrysotricha e de 0,014 (Tau22) e 0,382 (Tau18) para T. roseo-alba (Figura 10).

Tabela 5: Valores de p para o teste de desequilíbrio de ligação dos locos utilizados em Tabebuia chrysotricha e

Tabebuia roseo-alba. Pares de Locos p Tabebuia crhysotricha Tau12 X Tau15 0,0418 Tau12 X Tau17 0,0013 Tau12 X Tau22 0,0312 Tau12 X Tau28 0,0025 Tau15 X Tau17 0,1598 Tau15 X Tau22 0,2547 Tau15 X Tau28 0,5010 Tau17 X Tau22 0,0003 Tau17 X Tau28 0,1731 Tau22 X Tau28 0,0012 Tabebuia roseo-alba Tau18 X Tau21 _0,6742 Tau18 X Tau22 0,8567 Tau18 X Tau27 _0,6561 Tau18 X Tau28 0,7528 Tau18 X Tau31 _0,3606 Tau21 X Tau22 0,5283 Tau21 X Tau27 _0,2242 Tau21 X Tau28 100,0000 Tau21 X Tau31 _0,0419 Tau22 X Tau27 0,0204 Tau22 X Tau28 _0,2146 Tau22 X Tau31 0,1588 Tau27 X Tau28 _0,0538 Tau27 X Tau31 0,3009 Tau28 X Tau31 _100,0000

Teste realizado com FSTAT baseado em 100.000 permutações com p-valor corrigido (Bonferroni - nível nominal de 5%) igual a 0,000500 para T. chrysotricha e 150.000 permutações e p-valor corrigido igual a 0,000333 para T. roseo-alba.

Em T. chrysotricha, o Tau28 foi o loco que apresentou o alelo com maior frequência e também o que obteve a maior diferença, em relação ao segundo alelo mais frequente. Para T.

28 A heterozigosidade observada foi maior que a esperada para todos os locos de T.

chrysotricha e, portanto os valores de Fis foram negativos e não significativos. A exceção foi

o Tau15 que mostrou um Fis positivo e significativo. Considerando todos os locos, T.

chrysotricha apresentou heterozigosidade observada maior que a esperada, porém com Fis não

significativo (Tabela 4).

Em T. roseo-alba, dois locos apresentaram heterozigosidade observada maior que a esperada, porém os valores de Fis não foram significativos. Dos quatro locos que apresentaram

valores de heterozigosidade menores que o esperado, apenas três (Tau18, Tau27 e Tau28) obtiveram valores significativos, e positivos, de Fis. Considerando todos os locos, T. roseo-

alba apresentou heterozigosidade observada menor que a esperada com valor de Fis positivo e

29 0 0,15 0,3 0,45 Tau12 TC 0 0,15 0,3 Tau15 _TC 0 0,15 0,3 0,45 0,6 Tau17 TC 0 0,15 0,3 0,45 Tau18 TR 0 0,15 0,3 Tau21 TR 0 0,2 0,4 Tau 22 _TC TR 0 0,15 0,3 Tau27 TR 0 0,35 0,7 Tau 28 _TC TR 0 0,15 0,3 Tau31 TR

Figura 10: Distribuição das frequências alélicas encontrada nas populações de Tabebuia chrysotricha (TC) e Tabebuia roseo-alba (TR) no PEAMP. O eixo das ordenadas indica as frequências

30

4.2. E

STRUTURA GENÉTICA ESPACIAL

A distância par-a-par média foi de 190,55 e 110,08 metros para Tabebuia chrysotricha e T. roseo-alba respectivamente. Em T. chrysotricha essa distância variou de 0,01 a 701,93 metros, enquanto em T. roseo-alba a amplitude foi de 0,01 a 518,46 metros. Em ambas as espécies a maior concentração de pares de indivíduos se deu até os 200 m de distância, sendo que em T. chrysotricha também há uma concentração considerável de pares de indivíduos entre 500 e 600 metros de distância (Figura 11).

Figura 11: Distribuição das distâncias par-a-par dos indivíduos de T. chrysotricha (TC) e T. roseo-alba (TR) no

Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco.

A análise da estrutura genética espacial em Tabebuia chrysotricha indicou uma correlação positiva significativa entre o coeficiente de parentesco par-a-par (Fij) e o logaritmo da distância espacial para indivíduos localizados em sete das oito primeiras classes (1, 2, 3, 5, 6, 7, 8), ou seja, distancias de até 29,21 m (Figura 12 e Tabela 6). Já as classes 13, 16, 17, 18, 19 e 20, com distâncias a partir de 169,43 m, mostraram correlação negativa significativa.

A inclinação da regressão em T. chrysotricha se mostrou significativamente diferente de uma estrutura espacial aleatório. Entretanto, a intensidade da estrutura genética avaliada pelo Sp se mostrou fraca. Considerando a população como um todo, o coeficiente de parentesco (F) não foi significativo. A distância de dispersão de genes (Nb) foi igual a 50,00 (Tabela 7).

Em T. roseo-alba a maioria das classes de distância apresentaram coeficientes de parentesco par-a-par não significativos estatisticamente. Apenas a classe 7 (distância de 26,91

31 m a 30,11 m) apresentou correlação positiva significativa entre o coeficiente de parentesco par-a-par (Fij) e o logaritmo da distância e as classes 11 (47,26 m a 59,82 m) e 14 (167,59 m a 172,05 m) apresentaram correlação negativa significativa (Figura 13 e Tabela 6).

Figura 12: Relação entre o coeficiente de parentesco (Fij ± SE) e o logaritmo da distância entre indivíduos para

a população de Tabebuia chrysotricha. As linhas tracejadas correspondem ao intervalo de confiança a 95% de probabilidade baseado na hipótese nula de ausência de estrutura genética espacial. Os asteriscos (*) indicam os valores de parentesco significativamente maiores ou menores que o esperado para uma distribuição de genótipos espacialmente aleatória (p < 0,05) baseado em 10.000 permutações. Veja na Tabela 6 a distância máxima das classes.

Tabela 6: Distância máxima em cada classe de distância usada para análise da estrutura genética espacial em

Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba.

Classes de distância Distância máxima (m)

Tabebuia crhysotricha Tabebuia roseo-alba

1 2,40 3,19 2 4,25 7,58 3 5,92 12,17 4 8,50 17,28 5 13,09 22,31 6 15,81 26,91 7 18,81 30,11 8 29,21 34,68 9 39,02 37,75 10 67,37 47,26 11 154,14 59,82 12 169,43 155,00 13 177,60 167,59 14 201,42 172,05 15 503,81 179,01 16 511,72 183,44 17 515,95 187,06 18 519,79 330,59 19 530,67 345,35 20 702,00 518,51

32 A inclinação da regressão nessa espécie se mostrou significativamente diferente de uma estrutura espacial aleatório. Contudo, a intensidade da estrutura genética avaliada pelo Sp se mostrou ainda mais fraca que em T. crhysotricha. Considerando a população como um todo, o coeficiente de parentesco foi significativamente positivo. A distância de dispersão de genes (Nb) foi igual a 122,78 (Tabela 7).

Tabela 7: Estrutura genética espacial e distância de dispersão para Tabebuia chrysotricha e Tabebuia roseo-alba

no Parque Altamiro de Moura Pacheco.

Espécie F (SE) F1 (SE) bln Sp Nb

Tabebuia crhysotricha -0,0451 (0,1345) 0,0697* (0,0111) -0,0186066* 0,020 50,00 Tabebuia roseo-alba 0,3480* (0,1697) 0,0160 (0,0211) -0,0080143* 0,008 122,78

F – Coeficiente de parentesco (Loiselle et al., 1995); SE – desvio padrão; F1 - Coeficiente de parentesco da primeira classe de

distância; bln - inclinação da regressão baseado no logaritmo da distância; Sp – parâmetro de mensuração da intensidade da estrutura

genética espacial; Nb – distância de dispersão de genes. Os asteriscos (*) indicam os valores significativos de F, F1 e bln (p < 0,05)

baseado em 10.000 permutações.

Figura 13: Relação entre o coeficiente de parentesco (Fij ± SE) e o logaritmo da distância entre indivíduos para

a população de Tabebuia roseo-alba. As linhas tracejadas correspondem ao intervalo de confiança a 95% de probabilidade baseado na hipótese nula de ausência de estrutura genética espacial. Os asteriscos (*) indicam os valores de parentesco significativamente maiores ou menores que o esperado para uma distribuição de genótipos espacialmente aleatória (p < 0,05) baseado em 10.000 permutações. Veja na Tabela 6 a distância máxima das classes.

33

5. DISCUSSÃO

5.1. T

RANSFERIBILIDADE E CARACTERIZAÇÃO DOS LOCOS

A transferibilidade dos locos nas espécies estudadas foi baixa. Uma explicação para isso é a ocorrência de mutação nas sequências que flanqueiam as regiões microssatélites, impedindo o anelamento dos primers e, consequentemente, a amplificação da região microssatélite na PCR.

Segundo INNIS (1990), a utilização de diferentes temperaturas de anelamento pode trazer incrementos no sucesso da transferibilidade. Entretanto, é improvável que essa situação ocorra nesse caso devido a grande amplitude de temperaturas de anelamento testadas.

Embora a transferibilidade tenha sido baixa, essa foi considerada satisfatória, tendo em vista que os objetivos do estudo puderam ser concluídos. Além disso, o maior custo e tempo despendido para desenvolvimento de novos marcadores microssatélites tornam a transferibilidade mais praticável.

BRAGA et al. (2007) e FERES et al. (2009) também testaram a transferibilidade dos mesmos locos para indivíduos de T. roseo-alba com sucesso para 10 e 9 locos respectivamente. Contudo, os resultados diferiram, entre si e com o presente estudo, tanto para os locos que amplificaram quanto para suas temperaturas de anelamento.

A diferença de temperatura de anelamento encontrada nesses estudos pode ser explicada pela otimização da PCR. Já a divergência de amplificação provavelmente deve-se a características genéticas locais das populações testadas em cada estudo, indicando uma grande variação nas regiões flanqueadoras dos microssatélites nas diferentes populações dessa espécie.

MOREIRA et al. (2009), em um estudo de estrutura genética espacial, também realizou a transferibilidade desses locos microssatélites para a espécie Tabebuia ochraceae, conseguindo sucesso para apenas sete locos.

Todos esses resultados mostram que a transferibilidade dentro do gênero Tabebuia pode ser difícil, embora seja aceitável para estudos de diversidade genética e estrutura genética espacial.

34 O número de alelos nos locos genotipados diferiu daqueles encontrados por BRAGA (2006) em T. aurea, sendo em sua maioria inferior nesse estudo, com exceção dos locos Tau22 e Tau27 que apresentaram número de alelos maior em T. roseo-alba. Todavia, o menor número de alelos não refletiu em uma menor heterozigosidade observada que, para a maioria dos locos, foi maior nas duas espécies desse estudo.

A transferibilidade para T. ochraceae também resultou em menor número de alelos por loco, mas para essa espécie a heterozigosidade observada foi muito menor (MOREIRA et

al., 2009).

O número médio de alelos por loco encontrado para as espécies estudadas é semelhante ao encontrados em outros trabalhos sobre espécies arbóreas do Bioma Cerrado como: Caryocar brasiliense (10,6; COLLEVATTI et al., 2001), Tabebuia roseo-alba (14,9; FERES, 2009), T. ochraceae (6,42; MOREIRA et al., 2009) e T. aurea (14,9; BRAGA, 2006).

As populações das duas espécies estudadas apresentaram alta heterozigosidade média observada na área de estudo. Embora valores de heterozigosidade observada alta tenham sido descritos para outras espécies neotropicais (COLLEVATTI et al., 2001; JONES & HUBBELL, 2006), os valores de heterozigosidade média observada nesse estudo é maior que a encontrada para outras espécies do gênero Tabebuia (MOREIRA et al., 2009; MARTINEZ, 2008; BRAGA, 2006).

Em comparação com T. aurea (espécie onde os locos microssatélites foram desenvolvidos) (BRAGA, 2006), o número de alelos foram, em sua maioria, inferiores nesse estudo, com exceção dos locos Tau22 e Tau27 que apresentaram número de alelos maior para

T. roseo-alba. Todavia, a heterozigosidade observada foi, para a maioria dos locos, maior nas

duas espécies aqui estudadas. A transferibilidade dos mesmos locos para T. ochraceae (MOREIRA et al., 2009) também resultou em menor número de alelos por loco, mas para essa espécie a heterozigosidade observada foi inferior aquela encontrada por BRAGA (2006) em T. aurea.

A espécie T. chrysotricha apresentou índice de fixação (Fis) não significativo,

indicando que a heterozigosidade observada está dentro do esperado em equilíbrio de Hardy- Weinberg. Esse resultado diverge de outros estudos de genética de população com espécies do gênero Tabebuia (MOREIRA et al., 2009; BRAGA et al., 2007; MARTINS et al., 2008) onde foram encontrados coeficientes de endogamia significativos. Entretanto, são comuns os

35 estudos que descrevem populações de plantas com coeficientes de endogamia significativos (ver ALDRICH et al., 1998; CAVALLARI NETO et al., 2004; SOUZA et al., 2007).

Na população de Tabebuia roseo-alba, o Fis mostrou-se positivo e significativo

(0,284), mostrando que há excesso de homozigotos nessa população. Esse resultado sugere que o acasalamento entre indivíduos aparentados ocorre com frequência considerável nessa população. Outros estudos de genética de populações com essa mesma espécie (FERES, 2009; MARTINEZ, 2008) também encontraram alta heterozigosidade esperada e coeficiente de endogamia significativo. Entretanto, a heterozigosidade observada encontrada no PEAMP foi bem maior que àquela encontrada por MARTINEZ (2008) e em uma das populações estudadas por FERES (2009).

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