HOK: Kunstsenter i identitetskrise

A diarréia, condição patológica de múltiplas causas ocorre como conseqüência de alterações motilidade e acumulo de fluidos no trato intestinal, sendo o último decorrente do aumento da secreção de eletrólitos (diarréia secretora), ou o aumento da ingestão de substâncias osmótica (osmótica diarréia), ou ainda pela presença de microrganismo (Diarréia infecciosa) (BRIJESH et al. 2006). Deste modo, para a análise da atividade antidiarréica das folhas de cagaita foram levados em consideração alguns parâmetros tais como, o efeito sobre o balanço eletrolítico e motilidade intestinal, bem como a ação das amostras contra bactérias associadas a quadro de diarréia, tais como E. coli e Salmonella sp.

Os resultados referentes aos efeitos sobre o transito intestinal demonstrou significativa (P <0,05) redução da motilidade após a administração do extrato etanólico (400mg/kg) em comparação com o controle negativo (óleo rícino), conforme mostrado na Tabela 8. O extrato etanólico e a loperamida inibiram em 24 e 37% a diarréia induzida por óleo rícino, demonstrando que, o extrato etanólico possui boa atividade antidiarréica, sendo sua atuação inferior ao controle positivo (loperamida) em apenas 13%.

Esta inibição do transito intestinal é frequentemente encontrada em outros trabalhos, como por exemplo, Lantana camara L., Jatropha curcus, Dalbergia lanceolaria, Psidium

guajava, Xylocarpus granatum, Rhus javanica, Asparagus pubescens, Paederia foetida e Xylocarpus moluccensis (MUJUMDAR et al. 2000; NWAFOR et al. 2000; TANGPU e YADAV,

2004; MUJUMDAR et al. 2005; SAGAR et al., 2005; UDDIN et al. 2005; AFROZ et al. 2006; ROUF et al., 2007).

De um modo geral, estas plantas apresentam atividade antidiarreica em modelos de diarréia induzida por óleo de rícino ou sulfato de magnésio, bem como sobre o transito intestinal. Assim, como observado em outros estudos, o extrato etanólico da cagaita também apresenta atividade antidiarreica, seja ela no modelo de diarréia induzida por óleo de rícino ou

pela inibição do trânsito intestinal. Contudo, a atividade antidiarreica do extrato etanólico no modelo de diarréia induzida por óleo de rícino foi observada apenas após a primeira dose (800mg/kg). Aparentemente, a resposta do organismo frente ao extrato etanólico é dose- dependente, assim como observado com o extrato metanólico de Mentha microphylla, planta egípcia com atividade antidiarreica (0.4–2.8 mg. ml−1_{) no modelo de diarréia induzida por óleo}

de rícino em coelhos (ATTA e MOUNEIR, 2004). Há inúmeros fatores que podem ter acarretado a ausência de atividade após doses consecutivas desta amostra. Dentre estes fatores destaca- se a redução da concentração nas doses subseqüentes (T2 e T3), devido à morte de 50% dos animais bem como, uma possível tolerância dos animais a droga com o seu uso prolongado. Embora a atividade inibitória do quadro diarréico tenha sido observada somente após a dose única (800mg/kg) a redução da motilidade intestinal (400mg/kg) torna-se um fator preponderante para classificar o extrato etanólico como possível agente antidiarreico a ser usado futuramente. Entretanto, fica claro que a janela terapêutica desta amostra deve ser averiguada para que não cause danos aos usuários.

Tabela 7: Atividade antidiarreica do grupo experimental (infusão, extrato etanólico e aquoso)

utilizando óleo de rícino (laxante) como controle negativo e loperamida (antidiarreico) como controle positivo. Os animais dos grupos controles, positivo e negativo receberam loperamida (antidiarreico) e óleo de rícino (laxante), na dose de 4mg/kg e 10mL/kg, respectivamente. Aos animais do grupo experimental: infusão e extrato aquoso foram administrados 800mg/kg e ao grupo extrato etanólico administrou-se 400mg/kg.

Tratamento Porcentagem de inibição (%) P (t-Student)

EXTRATO AQUOSO 3,53 ± 1,41 NS EXTRATO ETANÓLICO 23,92 ± 3,06 <0.001 INFUSÃO 2,35 ± 3,58 NS LOPERAMIDA 37,06 ± 0,71 <0.001 ÓLEO DE RÍCINO 0 NS = não significativo

De modo geral, sabe-se que a inibição do trânsito intestinal pode acarretar em sérias modificações na secreção e absorção de fluídos pelo epitélio intestinal (SAGAR et al. 2005; AFROZ et al. 2006). Assim, é de suma importância que alterações, quanto ao equilíbrio eletrolítico, sejam analisadas. Ao analisar este parâmetro, foi possível constatar que, as amostras ao alterarem o trânsito intestinal provocaram significativos aumentos plasmáticos dos íons cloro, magnésio e fósforo, nos diferentes períodos (após uma dose, dose consecutiva por 7 e 14 dias). Provavelmente, a indução de diarréia por óleo de rícino, resultou em mudanças no transporte de água e eletrólitos, acarretando em uma resposta hiper secretória e no aumento do trânsito intestinal (SAGAR et al. 2005). Em virtude da ausência do efeito antidiarreico após o uso consecutivo do óleo de rícino, os níveis de cloro plasmático aumentaram significativamente após doses consecutivas por 14 dias. Este aumento foi em 22, 7 e 12%, nos animais que receberam loperamida, extrato etanólico e aquoso, respectivamente (Tabela 8). Este quadro hipoclôremico pode ocorrer como conseqüência das várias formas de acidose metabólica incluindo, o ganho de cloro e/ ou à perda de grande quantidade de bicarbonato, devido a um período prolongado de diarréia.

Tabela 8: Análise de cloro após a administração dos tratamentos em diferentes períodos: sem

tratamento (T0), após uma dose (T1), dose consecutiva por 7 (T2) e 14 (T3) dias. Os animais pertencentes ao grupo controle negativo receberam 3ml de água; ao controle positivo foram administrados loperamida na concentração de 4mg/kg ressuspenso em 3ml de água e os animais do grupo experimental tais como, infusão, extrato etanólico e aquoso as doses administradas foram 800mg/kg, 400mg/kg e 800mg/kg, respectivamente.

Níveis séricos de Cloreto (mEq/L)

Média ± desvio ± TO TI T2 T3 P (t-Student) ÁGUA 99,28 ± 0,05 95,45 ± 0,03 95,28 ± 0 94,02 ± 0,12 NS EXT. AQ. 94,8 ± 0,02 114,61 ± 0,08 90,46 ± 0,02 108,27 ± 0,02 0.03 EXT. ET. 106,47 ± 0,02 124,09 ± 0,04 104,42 ± 0,01 114,95 ± 0,02 0.01 INFUSÃO 100,23 ± 0,06 104,64 ± 0,05 99,48 ± 0,05 106,68 ± 0,04 NS LOPERAMIDA 102,45 ± 0,02 109,92 ± 0,05 109,98 ± 0,05 132,78 ± 0,09 < 0.001 NS = não significativo

Analisando os dados dos níveis plasmáticos de fósforo associados aos obtidos com a análise dos íons cloreto, pôde se identificar que após a administração de uma única dose, todos os tratamentos apresentaram uma redução dos níveis de fósforo em comparação com o período sem tratamento (Tabela 9). De modo geral, é possível observar que após uma dose do extrato aquoso, etanólico, infusão e loperamida, estes atuam de forma efetiva sobre o quadro de diarréia induzida por óleo de rícino, reduzindo em 22, 14, 28, e 50%, respectivamente.

Tabela 9: Análise de fósforo após a administração dos tratamentos em diferentes períodos:

sem tratamento (T0), após uma dose (T1), dose consecutiva por 7 (T2) e 14 (T3) dias. Os animais pertencentes ao grupo controle negative receberam 3ml de água; ao controle positivo foram administrados loperamida na concentração de 4mg/kg ressuspendido em 3ml de água e os animais do grupo experimental tais como, infusão, extrato etanólico e aquoso as doses administradas foram 800mg/kg, 400mg/kg e 800mg/kg, respectivamente.

Níveis séricos de Fósforo (mg/dL)

Média ± desvio ± TO TI T2 T3 P (t-Student) ÁGUA 7,96 ± 0,05 7,83 ± 0,09 8,73 ± 0,07 8,23 ± 0,06 NS EXT. AQ. 9,45 ± 0,08 7,03 ± 0,1 11,13 ± 0,07 15,26 ± 0,01 < 0.001 EXT. ET. 7,22 ± 0,06 6,43 ± 0,05 8,73 ± 0,07 14,46 ± 0,01 < 0.001 INFUSÃO 7,78 ± 0,07 5,22 ± 0,12 10,7 ± 0,08 14,46 ± 0,02 < 0.001 LOPERAMIDA 10 ± 0,05 5,22 ± 0,08 10,26 ± 0,09 13,86 ± 0,01 < 0.001 NS = não significativo

No entanto, com o uso prolongado a capacidade de retenção de fósforo no lúmem diminui e os níveis plasmáticos deste íon aumentam consideravelmente em 40, 50, 50 e 23% após doses consecutivas por 14 dias das amostras extrato aquoso, etanólico, infusão e loperamida, respectivamente.

O quadro de hiperfosfatemia revela um distúrbio na absorção intestinal ocasionada pela administração excessiva de laxativo (óleo de rícino) (LIMA, 2001). Cabe ressaltar que, todos os tratamentos incluindo a loperamida administrada aos animais (controle positivo), evidenciam a não contenção do quadro diarréico (GUYTON, 1993). Em princípio, este resultado pode ter ocorrido, porque a loperamida não exerce nenhum efeito direto sobre a absorção. Seu

mecanismo de ação deve se a interação com receptores μ-opióide, que determinam o retardamento do trânsito intestinal. Em adição, a exposição consecutiva deste medicamento no receptor acarreta no desenvolvimento de tolerância dos receptores a este fármaco. Deste modo, a eficácia de loperamida é questionável quando a administração é por período prolongado ou resulta em 30mg/kg (TAN-NO et al. 2003).

Outro íon analisado foi o magnésio, onde foi possível observar um aumento gradual de sua concentração após a administração de todas as amostras testadas, incluindo o controle positivo (loperamida). Este aumento por sua vez, chegou a 50% em relação ao período que antecedeu o experimento (Tabela 10). Novamente fica evidente que as amostras não conseguem reter o quadro diarréico, quando administrada uma dose de 3ml/kg de óleo de rícino, por um período prolongado.

Tabela 10: Análise de magnésio após a administração dos tratamentos em diferentes períodos:

sem tratamento (T0), após uma dose (T1), dose consecutiva por 7 (T2) e 14 (T3) dias. Os animais pertencentes ao grupo controle negativo receberam 3ml de água; ao controle positivo foram administrados loperamida na concentração de 4mg/kg ressuspendido em 3ml de água e os animais do grupo experimental tais como, infusão, extrato etanólico e aquoso as doses administradas foram 800mg/kg, 400mg/kg e 800mg/kg, respectivamente.

Níveis séricos de Magnésio (mg/dL)

Média ± desvio ± TO TI T2 T3 P (t-Student) ÁGUA 1,59 ± 0,01 1,73 ± 0,01 1,65 ± 0,02 1,75 ± 0,02 NS EXT. AQ. 1,59 ± 0,03 2 ± 0,02 2,54 ± 0,03 2,78 ± 0,05 0.03 EXT. ET. 1,67 ± 0,01 1,73 ± 0,01 2,44 ± 0,03 2,68 ± 0,05 < 0.001 INFUSÃO 1,59 ± 0,02 1,87 ± 0,02 2,54 ± 0,03 3,2 ± 0,03 < 0.001 LOPERAMIDA 1,5 ± 0,01 1,87 ± 0,01 2,15 ± 0,05 3,2 ± 0,03 0.04 NS = não significativo

Para melhor compreensão dos efeitos antidiarreicos da folha de cagaita, a infusão e o extrato etanólico foram avaliados quanto à atividade antibacteriana contra Salmonella spp. e E.

coli, bactérias essas associadas a inúmeros quadros de diarréia infecciosa. Como resultado,

foram obtidos uma redução do crescimento de E. coli, em cerca de 27,5% e 25,5% utilizando concentração final de 200 μg.mL- 1 _{da infusão e do extrato etanólico, respectivamente (Figura 5A}

e C). A avaliação da atividade antibacteriana das demais amostras frente a estas bactérias, resultou na ausência de inibição do crescimento bacteriano, mas capacidade inibitória por parte do controle negativo (cloranfenicol 20µg/ml), como pode ser observado nas figuras 4B e D.

Ressalva-se a importância deste dado, pois, sabe-se que o gênero Escherichia apresenta grande importância clínica devido às infecções oportunistas que estas causam. Atualmente, tem se o conhecimento que a E. coli, espécie mais comum deste gênero, representa um dos maiores problemas de saúde pública, devido as diferentes estratégias de patogenicidade adotadas por esta bactéria. Fato intrigante é que esta bactéria, em sua maioria, não apresenta patogenicidade, habitando os intestinos como membros da microbiota natural. Entretanto, com a precariedade das condições de saneamento de algumas populações de baixo nível socioeconômico, a E. coli pode provocar sérios danos em pacientes com defesas reduzidas evoluindo, até mesmo, para a morte do indivíduo (NEIDHARDT et al. 1996).

Figura 5: Bioensaio em meio LB ágar. Atividade antibacteriana das frações brutas, da infusão e

do extrato etanólico, nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0). a) Infusão contra E.

coli; b) Infusão contra Salmonella sp.; c) Extrato etanólico contra E. coli; d) Extrato etanólico

contra Salmonella sp. C1: DMF 10%; C0: DMF 5%; C+: controle positivo (cloranfenicol 20µg).

(a) (b)

O extrato etanólico e a infusão foram então, submetidos à separação por HPLC de fase reversa com o intuito de se obter a fração responsável por tal efeito revelando na infusão, a presença de três picos majoritários eluídos a 18, 27 e 49% de acetonitrila, para o extrato etanólico foram observados picos majoritários eluídos a 31 e 47% de acetonitrila. Deste modo, os picos obtidos do extrato etanólico e da infusão foram agrupados (AE, FI e JM) e (AB, CE e F), respectivamente. Estas frações foram avaliadas contra o crescimento de E. coli, obtendo-se como resultado a inibição de 47% do crescimento causada pela fração (FI) e 29% do grupo (JM) pertencente ao extrato etanólico (Figura 6A). Em se tratando da atividade das frações obtidas em RP-HPLC da infusão determinou-se uma inibição de 28% do crescimento de E. coli causada pela fração denominada F (Figura 6B). Deste modo, os valores obtidos com o uso de frações da folha de cagaita são de e suma importância, fornecendo assim, uma nova alternativa no combate a infecções intestinais.

Figura 6: Bioensaio em meio LB ágar. As frações obtidas por RP-HPLC (200µg cada) tiveram

sua atividade antibacteriana avaliada contra E. coli. A) Frações da infusão (AB, CE e F); B) Frações do extrato etanólico (AE, FI e JM). C(-): DMF 5%; C(+): controle positivo (cloranfenicol 20µg).

(a) (b)

Com o intuito de agregar uma maior potencialidade a estas frações, as análises da atividade antibacteriana foram expandidas infusão e ao extrato etanólico para alguns patógenos humanos, incluindo S. aureus, Proteus sp. e Klebsiella sp. A partir desta análise pôde se observar uma significativa redução do crescimento de S. aureus, em aproximadamente 33% e 40%, da infusão e do extrato etanólico, respectivamente (Figura 7A e D).

Figura 7: Bioensaio em meio LB ágar. Atividade antibacteriana contra S. aureus. A) Infusão

(bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0); B) Frações da infusão (AB, CE e F); C) Extrato etanólico (bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0); D) Frações do extrato etanólico (AE, FI e JM). C1: DMF 10%; C0: DMF 5%; C+: controle positivo (cloranfenicol 20µg)/ C(-): DMF 5%; C(+): controle positivo (cloranfenicol 20µg).

(a)

(b)

A avaliação da atividade antibacteriana de infusão e extrato etanólico sobre o crescimento de Klebsiella sp. e Proteus sp. resultou na ausência de inibição do crescimento bacteriano, como pode ser observado na figura 8.

Figura 8: Bioensaio em meio LB ágar. Determinação da atividade antibacteriana de A) Infusão

(bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0) sob o crescimento de Klebsiella

sp.; B) Extrato etanólico (bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0) sob o

crescimento de Klebsiella sp.; C) Infusão (bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0) sob o crescimento de Proteus sp.; D) Extrato etanólico (bruto) nas concentrações finais de 400µg (T1) e 200µg (T0) sob o crescimento de Proteus sp. C1: DMF 10%; C0: DMF 5%; C+: controle positivo (cloranfenicol 20µg)/ C(-): DMF 5%; C(+): controle positivo (cloranfenicol 20µg).

(a) (b)

Resultados semelhantes foram encontrados por Loguercio e colaboradores (2005) com o extrato hidro-alcoólico 10% (w/v), de folhas de E. jambolana, onde foi descrita a atividade antibacteriana, contra várias bactérias gram-positivas e gram-negativas, incluindo

Staphylococcus sp, Escherichia coli, Salmonella typhi e Proteus sp. O autor sugere que o efeito

antibacteriano seja dado ela presença de taninos, que por sua vez, se complexam com proteínas através de pontes de hidrogênio e efeitos hidrofóbicos, ou até mesmo por ligações covalentes (COWAN, 1999).

Há três hipóteses que tentam justificar a atuação dos taninos como antibacterianos. Primeira relacionada com inibição de algumas enzimas essenciais para os microorganismos, por meio de uma inibição competitiva com o substrato desta enzima. A segunda hipótese sugere que os mesmos atuem nas membranas celulares modificando o metabolismo; e terceiro que formam complexos com os íons metálicos, diminuindo a concentração de íons essenciais para os microrganismos metabolismo (SCALBERT, 1991).

Demais trabalhos também demonstram a atividade antimicrobiana de espécies pertencentes ao gênero Eugenia. Podemos citar, por exemplo, o estudo com óleo essencial de

E. uniflora, onde foi demonstrada a atividade contra bactérias Gram-positivas, tais como, Sarcina luteu e Mycobacterium phlei, bem como atividade antifúngica contra Candida albicans e Tricophyton mentagrophytes (KANAZAWA et al. 2000). Resultados similares foram encontrados

por Ali e colaboradores (2005) ao empregar o eugenol, composto fenólico encontrado no óleo essencial de E. caryophyllata, contra fungos e bactérias, observando a atividade contra o

Helicobacter pylori.