Os sagüis (5 e 6) foram transferidos do viveiros para as nas gaiolas e mantidos em regime de claro-escuro, sendo 12 h de claro (250 lx) e 12 h de escuro total. Esta condição foi mantida até que todos os animais estivessem devidamente sincronizados por pelo menos 7 dias. Após esse período, os animais foram submetidos à condição de claro constante com iluminação de intensidade fixa de 250 lux até expressarem seu ritmo sem referências de pistas ambientais (livre-curso). Após duas semanas em livre- curso foi aplicado um pulso de escuro com duração de 45’ (quarenta e cinco minutos), atingindo horas circadianas (HC) específicas dos sagüis previstas com auxílio do software El Temps (Antoni Diez-Noguera, Barcelona, 1999). Para fazer tal previsão calculamos o período endógeno do animal (
τ
) em décadas (dez dias, imediatamente antecedentes ao pulso) pelo teste Lomb-Scargle, obtendo um valor em minutos, o qual subtraído de 1440 min (equivalente à 24h) nos forneceu uma referência para a mudança de fase diária (MF). Em seguida, dividimos oτ
por 24 para encontrarmos asHCs (Fig.3). Assim, ajustamos o “timer” para interromper a passagem de corrente elétrica para as luzes da sala na hora prevista e com a duração desejada.
Um software (Aschoff) desenvolvido na base de pesquisa LabCrono/UFRN foi usado para registrar o ciclo de atividade/repouso de cada animal, utilizando para isto um sensor infravermelho (JFL-Equipamentos Eletrônicos, IDX-1000) adaptado à gaiola, que detecta cada movimento do animal gerando um sinal elétrico. O sinal elétrico gerado pelo sensor é enviado para uma placa de aquisição de dados, National Instruments (NI PCI – 6025E), que armazena informações de 05 minutos, totalizando 288 pontos de registro de atividade ao longo de 24 horas. Estas informações são usadas para se obter o perfil do ciclo atividade/repouso dos animais mantidos sob diversas circunstâncias experimentais. Estudos comparativos entre dados captados por softwares com dados obtidos através de registros de observação comportamental demonstram que 97% das vezes em que este tipo de sensor é ativado, o sinal corresponde ao deslocamento do animal, embora ele seja capaz de detectar qualquer tipo de movimento (Santos, 2000).
A determinação dos horários do início da atividade foi feito através da totalização dos dados em intervalos de 15 minutos e calculada a freqüência média diária de atividade. Como início da atividade (HC 0) foi considerado o primeiro intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média de atividade diária, que se manteve por um mínimo de 30 minutos dentro de 1 hora. Como fim da atividade foi considerado o último intervalo de 15 minutos com valor superior ou igual a 10% da média diária, antecedido por no mínimo 30 minutos de atividade dentro de 1 hora (critério adaptado a partir de Glass et al, 2001). O critério de definição da HC atingida pelo pulso de escuro foi determinado pelo início do pulso, mesmo que o término deste se extinguisse na HC subseqüente.
Os pulsos foram aplicados visando atingir as HCs 4, 10, 16 e 22. Esses pontos foram escolhidos por estarem com respostas bem caracterizadas na CRFs para pulso de escuro em outros trabalhos. Deu-se um intervalo de duas semanas entre um estímulo e o outro. O último pulso foi aplicado no dia subjetivo e na HC em que houve a maior mudança de fase com os pulsos anteriores, devido à predição de uma correlação positiva com expressão da proteína FOS no NPG. Trinta minutos após o último pulso, os sagüis (5 e 6) foram capturados, vendados, anestesiados, perfundidos, removido os
encéfalos, obtido cortes deste tecido (microtomia), servindo assim como nosso grupo experimental. Posteriormente foi realizada imunohistoquímica contra a proteína FOS, utilizada como indicador de atividade neuronal, assim como uma marcação com dupla peroxidase contra FOS e NPY. Para mensurar a expressão de FOS, o grupo experimental foi comparado ao do grupo controle utilizando como parâmetro o número de células FOS-positivas por campo (coincidente com os limites do NPG), em três níveis (rostral, médio e caudal) do NPG. Quatro indivíduos leigos no assunto foram instruídos a contar essas células, apenas com a informação das características que deveriam levar em consideração para computar essas células no ato da contagem. Para confirmar se há diferença entre os grupos seria necessário aplicar o teste T (Student), no entanto, devido ao baixo tamanho da amostra, não foi possível avaliar essa condição. Apenas utilizamos a estatística descritiva para apresentação dos dados. As ferramentas para análise da imunohistoquímica e digitalização das imagens foram semelhantes a do grupo anterior.
O objetivo deste experimento foi tentar responder as hipóteses iniciais sobre a natureza do pulso de escuro (baseando-se na resposta da expressão de FOS e comportamento da CRF), averiguar a existência de uma relação entre as mudanças de fase e a expressão de FOS no NPG e o papel do NPG dentro desse contexto como possível estrutura análoga ao FIG.
ح
ح
*1440 - ح = MF1440 -1370 = 70 * ح / 24 = HC 1370 / 24 ≈ 57
Figura 3 – Demonstração dos cálculos utilizados na previsão da HC para aplicação do pulso de escuro e sua respectiva resposta de fase. ح (período endógeno), (pulso de escuro, HC4), (linha de regressão linear), (resposta de fase), MF (mudança de fase diária) e HC (hora circadiana).
4.7.2 – Grupo Controle
O sagüi 7 foi submetido a mesma condição inicial do grupo anterior, mas não se aplicou o pulso de escuro, onde, partindo-se de uma HC equivalente ao dos animais do grupo anterior, fizemos a captura, vendamento, perfusão, remoção dos encéfalos, microtomia e imunohistoquímica contra a proteína FOS, servindo assim como nosso grupo controle.
4.7.3 – Curva de Resposta Dependente de Fase (CRF).
Durante todo o experimento, os animais 5, 6, 7, 8 e 9 receberam pulsos de escuro em HC’s distintas de acordo com as especificações descritas acima. As respostas comportamentais de cada um deles serviram para construção da CRF. Os animais 8 e 9 serviram apenas como fonte de dados para as respostas de fase e logo foram devolvidos aos viveiros ao término do desenho experimental.
As mudanças de fase foram calculadas pela diferença entre os horários estimados para o início da atividade, 1 dia após a aplicação do pulso, determinados pela regressão linear (GraphPad InStat) a partir do início da atividade 1-7 dias imediatamente antes ao pulso.
4.7.4 – Registro de Atividade Locomotora.
Os registros de atividade locomotora dos animais 5, 6, 7, 8 e 9 foram utilizados como parâmetro para avaliar quantitativamente quaisquer mudanças significativas no comportamento locomotor nos dias ou momentos em que esses animais foram estimulados. Aplicamos o teste ANOVA (Tukey-Kramer, pós-teste) para medidas repetidas a fim de averiguar diferenças na atividade locomotora no dia do pulso em relação ao dia imediatamente antecedente e subseqüente. Nesse caso, o tempo de atividade foi quantificado em segundos por intervalo de 5 min. O teste ANOVA (one- way, Tukey-Kramer, pós-teste ) foi utilizado para identificar se há diferenças na distribuição da atividade locomotora entre as HC’s e a acrofase desse comportamento. Não foi possível comparar o nível de atividade locomotora das HC’s atingidas pelo pulso com as demais fases devido ao baixo tamanho da amostra, no entanto, utilizamos a estatística descritiva para apresentar os dados obtidos nesses poucos animais. Nos dois últimos casos, totalizamos o tempo de atividade em segundos, somando-se a
quantidade de atividade por cada intervalo de 5 min dentro da HC em questão. O objetivo dessa análise foi verificar se o pulso de escuro induz incremento de atividade locomotora, a qual, segundo diversos pesquisadores, parece ser necessária para mudanças de fase em estudos feitos com roedores.
5. RESULTADOS