Uavhengige variabler

Após o sequenciamento do genoma humano, onde foram identificadas cerca de 20.000 a 25.000 regiões codificadoras para sequências de aminoácidos (LEVY et al., 2007), ficou claro que a ideia de um gene para uma função não se aplica para explicar todas as funções fisiológicas do nosso complexo organismo. O número de proteínas excede o número de genes, onde o splicing alternativo é tido como o mecanismo mais utilizado para gerar tal diversidade proteica (GRAVELEY, 2001; JOHNSON et al., 2003). O splicing alternativo permite que cada gene humano origine múltiplos transcritos que codificam proteínas com funções distintas e, portanto, diferentes consequências biológicas (GRAVELEY, 2001; FRASER e BICKMORE, 2007). Estima-se que dois terços dos genes humanos contêm um ou mais tipos de splicing alternativo (GRAVELEY, 2001). O estudo de Pan e colaboradores mostrou, ao usar técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS, do inglês Next Generation

Sequencing), que cerca de 95% dos genes humanos sofrem splicing alternativo (PAN et al.,

2008). Adicionalmente a esse mecanismo, podem ocorrer inúmeras modificações pós- traducionais (PTMs, do inglês post-translational modifications) que aumentam a diversidade de funções das proteínas já traduzidas (KOLCH, MISCHAK e PITT, 2005; LEVY et al.,

2007). Além desses mecanismos, foi observado na última década que, apesar das regiões codificantes representarem uma pequena porcentagem do genoma de mamíferos, praticamente todo o seu genoma é transcrito. Tal transcrição pode produzir, além de RNAs mensageiros (mRNAs), vários tipos de ncRNAs (CONSORTIUM, 2007; MATTICK, 2009). Assim, a importância do papel dos ncRNAs tem sido cada vez mais reforçada em pesquisas publicadas. Com o estudo desse transcriptoma, novos níveis de complexidade passaram a ser descritos, mostrando que tais RNAs também têm papel regulatório (JACQUIER, 2009).

Deste modo, o silenciamento de genes associado ao RNA tem sido outro mecanismo implicado na modificação epigenética. A regulação gênica mediada pelo RNA foi proposta pela primeira vez com a hipótese de que ncRNAs podem interagir com promotores a fim de regular genes. Estudos com Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, células vegetais e de mamíferos mostraram a participação de RNA interferente (RNAi), histonas e modificações no DNA em mecanismos de silenciamento transcricional (ZARATIEGUI et al., 2007). Um processo bem descrito consiste na inativação do cromossomo X em fêmeas e compensação de dosagem, que está estreitamente ligado a ncRNAs, levando a mudanças na estrutura da cromatina para silenciar a transcrição de genes ligados ao cromossomo X (PANNING e JAENISCH, 1998; BERNSTEIN e ALLIS, 2005; PAULER, KOERNER e BARLOW, 2007). Os efeitos do RNAi podem causar degradação de RNA, inibição traducional, mudanças na cromatina ou uma combinação desses. O RNAi pode usar microRNAs (miRNAs) para mediar silenciamento de genes da heterocromatina e prevenir a mobilização de elementos de transposição (BERNSTEIN e ALLIS, 2005; KIM et al., 2009).

Podem ser definidas duas grandes categorias destes transcritos: RNAs pequenos (sRNAs, do inglês small RNAs), que possuem entre 20 e 300 bases nucleotídicas, e RNAs longos não codificantes (lncRNAs, do inglês long noncoding RNAs), que se encontram na faixa entre 300 nucleotídeos e 1 kb (COSTA, 2010). Existem transcritos não codificadores que são encontrados em todas as células do organismo, assim como aqueles encontrados em tecidos e tipos celulares específicos (JACQUIER, 2009).

2.3.2 MicroRNAs

Entre os ncRNAs descritos, os miRNAs, que estão incluídos no grupo de sRNAs, correspondem à classe mais conhecida e estudada e são RNAs com aproximadamente 22

bases, conservados entre espécies e não codificantes que atuam principalmente na repressão gênica pós-transcricional (SHIVDASANI, 2006), apesar de ativação gênica pós-transcricional também ter sido descrita (VASUDEVAN, TONG e STEITZ, 2007; OROM, NIELSEN e LUND, 2008). Portanto, costuma haver uma relação inversa entre a quantidade de miRNA e mRNA alvo (GUO et al., 2010).

O papel dos miRNAs na regulação de processos biológicos ao reprogramar o transcriptoma e o proteoma celular tem sido constantemente confirmado desde sua descoberta em nematóides em 1993 (LEE et al., 1993; FILIPOWICZ, BHATTACHARYYA e SONENBERG, 2008; GUO et al., 2010). Já foi mostrado que eles têm papel fundamental em diversos processos biológicos e patológicos, como apoptose, metabolismo e tumorigênese (RAO et al., 2006). Estima-se que miRNAs regulem mais de 60% de mRNAs em humanos (FRIEDMAN et al., 2009), sendo que cada miRNA pode ter como alvo vários mensageiros (BRENNECKE et al., 2005; LEWIS et al., 2005). Desde a identificação dos primeiros miRNAs usando técnicas experimentais tradicionais, avanços metodológicos como bioinformática e NGS permitiram a identificação de um grande número de miRNAs em diferentes organismos. Até hoje, mais de 20.000 miRNAs foram identificados em animais, plantas e vírus (versão 19, www.mirbase.org) (GRIFFITHS-JONES et al., 2008).

Os miRNAs maduros derivam de transcritos maiores denominados miRNAs primários (pri-miRNAs) e podem vir de genes individuais, regiões intrônicas de genes codificadores de proteínas ou transcritos policistrônicos, sendo que a maioria corresponde ao segundo tipo (LAGOS-QUINTANA et al., 2001; LAU et al., 2001; LEE e AMBROS, 2001). É frequente que transcritos primários gerados a partir de unidades policistrônicas contenham vários miRNAs (HOLLEY e TOPKARA, 2011). A maioria dos pri-miRNAs pode ser transcrita e processada da mesma maneira que genes codificantes de proteínas, ou seja, é transcrita pela polimerase II e recebe a 5’cap e a cauda poli-A, no entanto, possui uma estrutura em grampo (hairpin). Esta estrutura é característica dos pri-miRNAs e é essencial para que sejam reconhecidos e processados no núcleo pela enzima RNase III, Drosha. O produto da Drosha consiste em um miRNA precursor (pre-miRNA) de aproximadamente 70 nucleotídeos também com hairpin, que é exportado para o citosol, onde é processado pela Dicer, outra enzima RNase III, para gerar um miRNA de fita dupla (~22 pb). Normalmente, uma destas fitas, chamada de fita guia, corresponde ao miRNA maduro, que se encontra na base do

do inglês RNA-induced silencing complex) (LEE et al., 2002; GREGORY et al., 2004). O RISC associado ao miRNA maduro interage com os mRNAs alvo por complementaridade parcial para degradá-los ou reprimir sua tradução (Figura 4) (ETHERIDGE et al., 2011). Apesar de acreditar-se que, quando a primeira fita é incorporada ao RISC, a outra fita é degradada, há evidências que, em alguns casos, ambas as fitas são funcionais (HU et al., 2009).

Figura 4. Biogênese de miRNAs.

Fonte: adaptado de Mack (2007).

A biogênese de miRNAs começa com a transcrição do pri-miRNA que é processado, ainda no núcleo, pela Drosha para produzir o pre-miRNA. Esse é exportado para o citosol e processado pela Dicer, gerando miRNA maduro fita dupla. Uma das fitas é incorporada ao RISC, que regula negativamente a expressão de mRNAs alvo, seja por degradação, seja por repressão da tradução.

Em geral, os miRNAs interagem com a região 3’-UTR de mRNAs, no entanto, já foi documentado que eles também podem se ligar a regiões 5’-UTR (LEE et al., 2009). Em animais, é devido à complementaridade imperfeita de ligação que um único miRNA pode ter como alvo centenas de mRNAs e um mRNA pode ser alvo de vários miRNAs, formando uma complexa rede regulatória (FRIEDMAN et al., 2009; CORTEZ et al., 2011). Seja de um modo ou de outro, os miRNAs podem ser capazes de alterar a expressão proteica, afetando redes e vias metabólicas (MACK, 2007; COSTA, 2010). Nos seis últimos anos, estudos evidenciando alterações na expressão de miRNAs associadas à adaptação ao exercício têm reforçado que

estas moléculas desempenham papel importante no desenvolvimento muscular, bem como na resposta do músculo ao estresse (VAN ROOIJ, LIU e OLSON, 2008; NIELSEN et al., 2010).

Os miRNAs têm sido encontrados em amostras de diferentes origens, como músculo (CHEN et al., 2006; AOI et al., 2010; DAVIDSEN et al., 2010), coração (CORDES et al., 2009; BOSTJANCIC et al., 2010), cérebro (SCHRATT et al., 2006; BEVERIDGE et al., 2010), ossos (LI et al., 2008; INOSE et al., 2009), tumores (HUANG et al., 2010; LI et al., 2010) e sangue (MITCHELL et al., 2008; LATERZA et al., 2009; HUANG et al., 2010; KROGH et al., 2010; WANG, G.K. et al., 2010). Recentes análises indicaram vários miRNAs altamente expressos de modo tecido-específico em órgãos como fígado, cérebro, pâncreas, além de músculo cardíaco e estriado (SOOD et al., 2006). Os miRNAs expressos em grandes quantidades em músculos são chamados de miRNAs músculo-específicos (myomiRs). Vários estudos têm mostrado consistentemente o miR-1, miR-133 e miR-206 como músculo- específicos, sendo denominados de myomiRs canônicos (SEMPERE et al., 2004; MCCARTHY e ESSER, 2007; MCDANELD et al., 2009). Esses aumentam em quantidade durante a diferenciação e a proliferação das células musculares cardíacas e esqueléticas (CHEN et al., 2006; TATSUGUCHI et al., 2007). Mais recentemente, a família dos myomiRs passou a incluir o miR-208 (a e b), -499 e -486 (MCCARTHY, 2011). Entre esses, o miR-208a é específico do músculo cardíaco (VAN ROOIJ et al., 2007).

Sokol e Ambros (2005) verificaram pela primeira vez a importância dos myomiRs no desenvolvimento muscular em moscas. Eles observaram que a deleção de miR-1 em D.

melanogaster causava morte prematura devido ao mau desenvolvimento dos músculos

esqueléticos ainda no estágio larval (SOKOL e AMBROS, 2005). O mesmo papel dos myomiRs foi demonstrado em camundongos. O miR-1 e o miR-2 mostraram ser necessários para a morfogênese cardíaca e a progressão do ciclo celular. O miR-208 está envolvido na regulação dependente de estresse da expressão da cadeia pesada de β miosina (VAN ROOIJ et al., 2007; ZHAO et al., 2007; MCCARTHY, 2008). Dois estudos independentes, um em ratos e outro em humanos, evidenciaram que o miR-208 em plasma está relacionado a danos em músculo cardíaco (JI et al., 2009; WANG, G.K. et al., 2010).