Para se realizar o nocaute de autofagia e observar assim a real função da autofagia no combate ao Pb, foi usado RNA interferente para realizar o silenciamento gênico do gene ATG5. O vetor escolhido para transportar o RNAi para o interior da célula foi um vetor lentiviral de terceira geração, onde existe a separação dos genes de interesse em 4 plasmídeos diferentes.
Foram multiplicados e purificados os plasmídeos necessários para a formação dos lentivírus, de acordo com a figura 09.
Figura 09 - Resultado da purificação dos plasmídeos de empacotamento
lentiviral e shRNA.
A partícula lentiviral foi produzida pelo processo de transdução em células HEK 293t. Após esse processo, os lentivírus concentrados foram contados pelo equipamento qNano, obtendo os seguintes resultados:
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Tabela 01 - Quantificação das partículas lentivirais para ATG5 de macrófago de
camundongo no equipamento qNano. Amostras diluídas em PBS.
Amostra Diluição da amostra Concentração Bruta (partículas/mL) Diâmentro médio da partícula (nm) Taxa de partículas por minuto Partículas contadas 305 1:2 2,0e+10 124 1017,2 547 306 1:5 2,4e+10 117 483,6 523 307 1:5 1,3e+10 135 273,4 512 308 1:10 6,3e+10 121 63,7 517 309 1:10 2,4e+10 161 238,8 490 EGFP 1:5 6,5e+09 153 131,2 493
A figura seguinte mostra um histograma com a sobreposição da distribuição dos tamanhos encontrados nas cinco amostras diferentes. O tamanho de um lentivírus varia de 80 a 100nm, e nessa faixa onde se deseja encontrar a maior concentração de partículas observadas pelo equipamento.
Figura 10 – Imagem de sobreposição dos histogramas de distribuição de
tamanho. Amostra 305 (Diâmetro): Moda: 104 nm; Média: 124 nm; Máximo: 284 nm; Mínimo: 80 nm; Concentração Bruta (partículas/mL): 2,0e+10; Amostra
306 (Diâmetro): Moda: 93 nm; Média: 117 nm; Máximo: 274 nm; Mínimo: 79 nm;
Concentração Bruta (partículas/mL): 2,4e+10; Amostra 307 (Diâmetro): Moda: 101 nm; Média: 135 nm; Máximo: 387 nm; Mínimo: 81 nm; Concentração Bruta (partículas/mL): 1,3e+10; Amostra 308 (Diâmetro): Moda: 96 nm; Média: 121 nm; Máximo: 431 nm; Mínimo: 82 nm; Concentração Bruta (partículas/mL): 6,3e+10; Amostra 309 (Diâmetro): Moda: 114 nm; Média: 161 nm; Máximo: 312 nm; Mínimo: 82 nm; Concentração Bruta (partículas/mL): 2,4e+10; Amostra
EGFP (Diâmetro): Moda: 95 nm; Média: 153 nm; Máximo: 382 nm; Mínimo: 85
nm; Concentração Bruta (partículas/mL): 6,5e+09.
O controle negativo está representado na figura 11, onde é possível ver a presença de partículas de diâmetros variados, mas que se apresentam em maior quantidade na faixa de 100 a 300nm, diâmetro maior que o esperado para uma partícula lentiviral. Pode-se concluir que as partículas encontradas no controle negativo são restos de reagentes, agregados de partículas e restos celulares que conseguiram continuar nas amostras mesmo após o passar pela etapa de filtração antes da leitura no qNano.
Figura 11 – Controle negativo da quantificação lentiviral no qNano. As mesmas
condições do experimento de transfecção de HEK 293T para produção lentiviral foi realizada, porém sem a adição de qualquer plasmídeo. Um pool foi feito com as amostras coletadas de seis poços diferentes. Diâmetro médio das partículas: 175nm; Concentração média: 2,6e+10 partículas/ml.
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6.2. EXTRAÇÃO DE RNA
O próximo passo foi observar a capacidade de knockdown dos lentivírus no gene ATG5 em células J774. Para isso, o RNA total das células J774 foi extraído após as células serem transduzidas. Observa-se na figura 15 que o RNA total foi extraído com êxito.
Figura 12 – Resultado do knockdown da autofagia em células J774. Referentes
às amostras, em cada poço tem: n° da mostra lentiviral/quantidade em µl de lentivírus colocado na cultura celular para transdução. Os poços referentes às amostras 307/50, 309/100 e EGFP/5 estão vazios por diferentes razões: 307/50 – erro de pipetagem; 309/100 – cultura celular contaminada; EGFP – transdução sem sucesso. Observa-se a grande quantidade de RNAs ribossomais 18s e 16s.
6.3. ENSAIO DE KNOCKDOWN
Na figura 13 está o valor absoluto de expressão do gene ATG5 após o knockdown com todos os cinco tipos de lentivírus formados. Os que apresentam a menor expressão genética são os lentivírus escolhidos para prosseguir com o desenho experimental, que foi a infecção das células com knockdown com o
Paracoccidioides.
Figura 13 – Resultado do qPCR. Expressão absoluta do gene em unidades
arbitrárias (UA), que é o resultado da razão entre a eficiência da reação (Q) e o fator de normalização da amostra. Esse fator representa a expressão de um gene dentro da amostra estudada. O gene endógeno usado como controle do teste foi o ACT1. No gráfico é possível observar que os lentivírus 305 e 306 na menor concentração obtiveram a menor expressão do gene ATG5.
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6.4. CONTAGEM DE CFU
Os lentivírus 305 e 305 na menor concentração foram usados para realizar novamente o experimento de transdução em células J774. Os macrófagos transduzidos foram infectados com Pb e ativados com IFN- e posteriormente lisados. A figura 14 mostra a contagem das unidades formadoras de colônias – UFC ou CFU, e a análise estatística realizada em cima do resultado obtido com a contagem.
Figura 14 - Teste de atividade antifúngica de macrófagos infectados com P.
brasiliensis. Macrófagos J774 transduzidos com dois diferentes shRNAs cujo alvo é ATG5 ("305" e "306") e com um shRNA controle negativo ("EGFP") foram infectados com P. brasiliensis durante 24 h em meio de cultura contendo IFN- gama. A amostra "J774" corresponde a macrófagos não transduzidos igualmente infectados e "Pb" corresponde a controle com poços contendo somente o fungo e meio de cultura, sem macrófagos. Após as 24 h de co-cultura, os macrófagos foram lisados e os fungos coletados e plaqueados para contagem de unidades formadoras de colônias. Análise estatística por ANOVA foi estatisticamente significativa (p<0,05), mas pós-testes mostraram diferença estatisticamente
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 U n id ad e s Arb itrá ri as Amostras
significativa somente da amostra "Pb" em relação à referência "EGFP". As barras correspondem a erro padrão da medida. Para cada grupo n = 4.
6.5. ENSAIO DE IMUNOLOCALIZAÇÃO
Nas figuras 15 e 16 pode-se observar células sem transdução infectadas com fungos RAW264.7, Pb01, Pb265 e Pb18. Com a imunolocalização de LC3, é possível observar a formação de um autofagossomo ao redor do fungo no citoplasma celular.
Figura 15 – Imunolocalização de LC3 (verde) em células RAW264.7 infectadas
com Pb01 e Pb265. (A) Controle não corado – controle de autofluorescência com células RAW264.7 não infectadas e não coradas. (B) controle corado – controle negativo com células RAW264.7 não infectadas e coradas com anticorpos primário e secundário. (C) Pb 01 e Pb265– Células RAW264.7 infectadas com Pb265 e Pb01 e coradas com anticorpos primário e secundário.
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Figura 16 – Imunolocalização de LC3 (verde) em células RAW264.7 infectadas
com Pb18 e C. neoformans. (A) Pb18 – Controle negativo para garantir que o Ac secundário não está se ligando inespecificamente. São células RAW264.7 que foram infectadas com Pb18 e coradas somente com o anticorpo secundário. (B)
Cryptococcus neoformas – Controle positivo, com C. neoformans que se
DISCUSSÃO
Os vetores lentivirais são capazes de transferir para a célula alvo insertos grandes. Possuem baixa imunogenicidade e podem infectar células quiescentes. Foram produzidos nesse trabalho em pequena escala com auxílio de compostos lipossomais, por meio da transfecção transiente de uma linhagem celular empacotadora, HEK 293T (TISCORNIA, 2006). Os lentivírus são vírus envelopados com pequenas projeções do envelope dispersas por sua superfície, pleomórficos, esferóides e com diâmetro de 80-100nm. O aumento de temperatura é capaz de inativar esse vírus, além da sensibilidade à ação de produtos químicos como fenóis, detergentes, hipoclorito, formalina e compostos quaternários de amônio (SILVA, 2007).
O objetivo de realizar o nocaute da autofagia, observando assim a real função desse mecanismo no combate ao Pb, foi possível pelo uso de RNA interferente – RNAi, que são originadas de moléculas de RNA de dupla fita gerados a partir da transdução de shRNA. O silenciamento gênico acontece pelo pareamento do siRNA de forma parcial ou total com o mRNA de interesse, impedindo sua tradução (HAMMOND, 2000). O alvo dos shRNA usados foi o RNAm transcritos do gene ATG5 de camundongo.
O vetor escolhido para transportar o RNAi para o interior da célula foi um vetor lentiviral por ser um vetor capaz de inserir o gene de interesse no genoma do hospedeiro, fazendo com que a replicação do gene seja feita pela própria célula hospedeira e diminui assim as chances de que a célula ataque a molécula formada. O lentivírus pertence ao gênero retrovírus e possui um período de incubação relativamente longo. O lentivírus produzido nesse trabalho é de terceira geração, onde existe a separação dos genes de interesse em 4 plasmídeos diferentes, para aumentar o título de produção lentiviral e a biossegurança, evitando uma possível restauração do fenótipo original
(TENÓRIO, 2008).
A leitura no qNano das amostras coletadas do cultivo de HEK 293T para a produção de lentivírus demonstrou a existência de partículas com o diâmetro lentiviral no sobrenadante. Cinco tipos de RNAi foram confeccionados para o
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mesmo alvo e posteriormente testados com o objetivo de observar qual possui melhor eficiência no nocaute do gene.
Segundo as concentrações obtidas com o qNano, a amostra com maior concentração de partículas, fora o controle fluorescente EGFP, é a amostra 308, com 6,3e+10 partículas por mL. Porém isso não significa que todas as partículas contadas representam partículas lentivirais. Restos celulares, corpos multivesiculares e pequenas partes da membrana que formam micelas podem estar presentes na amostra mesmo depois da centrifugação realizada para sedimentar restos celulares após a coleta do sobrenadante, e antes da centrifugação para concentração dos lentivírus. Isso pode ser observado na figura 13, com distribuição de tamanho das partículas encontradas em cada amostra. A variação de tamanho encontrada revela a presença de outras partículas.
Para se ter uma noção se a contagem foi de partículas lentivirais ou de restos celulares, o mesmo experimento foi realizado sem a adição de plasmídeos de formação do vetor lentiviral nem do plasmídeo para transcrição do RNAi. Por comparação dos resultados obtidos com a leitura dessas amostras com as amostras do experimento, concluímos que as partículas lidas pelo qNano que tinham o diâmetro maior que 100nm eram, de fato, restos celulares, corpos multivesiculares e partículas oriundas dos reagentes lipossomais usados na metodologia do experimento.
O gene ATG5 codifica a proteína Atg5 que é uma E3 ubiquitina-ligase, necessária no estágio de elongação do autofagossomo, sendo ativada pela proteína Atg7 e, posteriormente, forma um complexo com Atg12 e Atg16L1. Este complexo desempenha função importante na conjugação do LC3-I ao PE, formando o LC3-II, marcadores que sinalizam que o processo autofágico foi completado (CODOGNO, 2006).
Os lentivírus 305 e 306 na menor concentração foram os que apresentaram menor expressão genética. Esse resultado pode ser atribuído ao efeito prozona, onde as amostras com maior concentração de lentivírus não puderam realizar o silenciamento genético por apresentarem mais RNAi do que gene para ser silenciado, levando a um resultado “falso-negativo”, como se não houvesse RNAi na amostra. Por esse motivo, as células transfectadas com amostras lentivirais
de menor concentração foram os escolhidas para o experimento de contagem das unidades formadoras de colônia, além da amostra com o lentivírus com EGFP, que vai demonstrar que a célula foi transduzida com sucesso e continua seu ciclo de vida (BAENS, 2006).
Macrófagos de camundongos foram usados nos experimentos. Uma das diferenças entre macrófago humano e de camundongo é falta de capacidade do macrófago humano de aumentar a expressão de arginase 1, um importante marcador da regulação de IL-4 de macrófago de camundongos (GEISSMANN,2010).
Os macrófagos são células fagocíticas encontradas em todos os tecidos do organismo humano. Têm diferentes origens como medula óssea e saco vitelino, além de possuir complexidade transcricional, são capazes de mudar seu fenótipo de acordo com a necessidade (WYNN, 2013). Várias tentativas foram feitas para classificar os macrófagos como o sistema fagocítico mononuclear (mononuclear
phagocytic system – MPS), o qual considera duas classes, a de células final da
linhagem fagocítica e os progenitores na medula óssea, levando em conta os macrófagos como células finais na linhagem fagocítica. Outra tentativa se refere a uma classificação binária que considera os estados inflamatórios para categorizar os macrófagos quando eles estão ativados e macrófagos ativados alternativamente (alternatively actvated macrofage - AAM), sendo estes estados definidos pela resposta a citocina interferon- (IFN- ), ativação de receptores “Toll-like” (TLRs) e interleucina 4 (IL-4) e IL-13, respectivamente (ARIEL, 2012). Os fungos de interesse desse trabalho são P. brasiliensis e P. lutzii, fungos dimórficos cuja interação patógeno-hospedeiro, mais especificamente relacionada ao macrófago, ocorre de forma semelhante a que acontece com C.
albicans. Um mecanismo que normalmente é conhecido apenas para reciclagem
celular, como a autofagia, também pode desenvolver um papel importante no desenvolvimento da infecção. A autofagia era considerada apenas um processo catabólico para manter a homeostase celular em uma via dependente de lisossomo. Hoje, seu papel imunológico é reconhecido como de grande importância em infecções (VURAL, 2014).
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As infecções fúngicas sistêmicas, como a PCM, são primeiramente combatidas pelo sistema imune inato. A interação patógeno-hospedeiro decorrente de uma infecção determina o desenvolvimento da doença. Um modelo de interação muito estudado é a que ocorre entre Candida albicans (C.
albicans) e o macrófago (NETEA, 2008). Esse fagócito, como outros do sistema
imune inato, reconhece patógenos fúngicos por meio de PAMPs – padrões moleculares associados a patógenos, cujos mais importantes são os carboidratos da parece celular fúngica: mananas, -glicanas e quitina (JIMÉNEZ- LÓPEZ, 2013).
A ativação clássica dos macrófagos ocorre pela combinação de dois sinais, IFN e o fator de necrose tumoral (TNF), que aprimora a capacidade do macrófago de combater infecções. INF é produzido pelas células NK como resposta a estímulos relacionados ao estresse e infecções, levando os macrófagos a secretarem citocinas pró-inflamatórias, aumentando a resistência do hospedeiro às infecções (MOSSER, 2008). Por isso, espera-se que os macrófagos que foram ativados com INF tenha uma maior capacidade de conter a infecção fúngica, reduzindo assim a quantidade de CFU’s.
A análise estatística por ANOVA, feita com base nos resultados encontrados da contagem de CFU’s, mostrou que não houve diferença estatisticamente significativa entre os macrófagos que receberam a transdução e os que não receberam. Isso pode ter ocorrido devido ao fato de apenas um dos genes que estão envolvidos na formação do autofagossomo ter sido alterado, possibilitando à célula lançar mão de outros mecanismos para compensar essa falta, pois a autofagia não é o único mecanismo imunológico para conter a infecção. Se mais de um gene responsável por formar o autofagossomo for alterado, existem maiores chances da diferença estatística ser mais relevante.
No resultado obtido com o ensaio de imunolocalização, pôde-se observar a ação do mecanismo autofágico contra a infecção por isolados das duas espécies de Paracoccidioides. O marcador de autofagossomo, a proteína LC3, pôde ser identificado ao redor das três linhagens fagocitadas pelo macrófago. O controle negativo corado demonstra a proteína LC3-I livre no citosol mostrando, pelo marcador escolhido, a capacidade inata da célula de formar um autofagossomo.
Com as outras condições experimentais pode-se observar a autofagia agindo na contenção da infecção, ao se observar o acúmulo de LC3 ao redor dos fungos usados na infecção. O anticorpo primário foi o IgG policlonal de coelho contra LC3 humana, e o secundário foi o IgG de cabra anti-IgG de coelho conjugado à CF88. Os vários pontos dispersos na célula representam o LC3 antes da lipidação, que naturalmente está presente no citoplasma. O acúmulo de LC3 ao redor do fungo demonstra a atividade imunológica que esse mecanismo também desempenha, ao conter seu crescimento intracelular, impedindo que o fungo tenha livre acesso às moléculas citoplasmáticas e levando o microrganismo para ser degradado por lisossomos.
A proteína de cadeia leve 3 (LC3) é normalmente usada como padrão ouro de identificação da formação do autofagossomo, indicando sua formação ou bloqueio de maturação (VIRGIN, 2009). Sua identificação geralmente é realizada por ensaios de imunolocalização com anticorpos conjugados, como o realizado nesse trabalho. Por ser previamente conhecido que o Cryptococcus neoformans se encontra em um autofagossomo durante sua infecção em macrófagos (NICOLA ET AL., 2012), este microrganismo foi escolhido como controle positivo, sendo possível validar o experimento.
Em outros trabalhos, já foi comprovada a ação de reconhecimento de fungos por macrófagos (ESTEBAN, 2011) e a participação da autofagia no combate a infecções bacterianas e virais tem sido estudada de forma extensiva, com a finalidade de encontrar meios alternativos de combate as doenças que mais afetam a população no geral (DERETIC, 2013).
Apesar da paracoccidioidomicose não ser uma doença de notificação compulsória, sua ocorrência na América do Sul, sendo o Brasil o local de maior endemicidade, e as lesões decorrentes da doença nos levaram ao estudo de mecanismos alternativos de combate a infecção usados pelas células imunitárias.
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CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
A produção lentiviral foi satisfatória, pois a menor concentração já foi o suficiente para alcançar o resultado desejado: produzir uma linhagem celular de camundongo geneticamente alterada. A partir desse momento, foi possível observar in vitro a infecção com o gênero Paracoccidioides.
O presente estudo mostrou que a atividade imunológica da autofagia existe, porém será estatisticamente significante se estudos posteriores envolvendo o knockdown de mais de um gene responsável pela formação do autofagossomo forem realizados. Essa etapa fica como sugestão para um futuro trabalho, no qual pode ser usada a célula THP-1 para passar pelo processo de nocaute dos genes ATG5 e ATG7. Essa linhagem celular, proveniente de uma leucemia monocítica aguda, é um valioso modelo no estudo dos mecanismos da homeostase e diferenciação de macrófagos.
Estudos posteriores mais extensivos e aprofundados podem direcionar os resultados a uma melhoria no tratamento de portadores da PCM.
REFERÊNCIAS
Ariel, A.; Maridonneau-Parini, I.; Rovere-Querini, P.; Levine, J. S.; Mühl, H.;
Macrophages in inflammation and its resolution; Frontiers in Immunology, v.
3, Article 324; November, 2012.
Auwerx, J.; The human leucemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation. Experientia, v. 15; n. 47; p. 22-31; Janeiro, 1991.
Bagagli, E. et al. Paracoccidioides brasiliensis: phylogenetic and
ecological aspects. Mycopathologia. v.165; p. 197–207, 2008.
Baens, M.; Noels, H.; Broeckx, V.; Hagens, S.; Fevery, S.; et al; The Dark Side
of EGFP: Defective Polyubiquitination. PLoS ONE, v. 1, n. 1, p. 54;
doi:10.1371/journal.pone.0000054, 2006.
Blanco J. L., Garcia M. E.; Immune response to fungal infections. Vet Immunol Immunopathol, v. 125; p. 47–70, 2008.
Botts M. R., Hull C. M.; Dueling in the lung: how Cryptococcus spores race
the host for survival. Curr Opin Microbiol, v. 13, p. 437–442; 2010.
Castro, L. F. et al; Characterization of the immune response in human
paracoccidioidomycosis; Journal of Infection, v. 67, p. 470 a 485; 2013.
Carrero L.L., et al; New Paracoccidioides brasiliensis isolate reveals
unexpected genomic variability in this human pathogen. Fung Genet Biol,
v. 45, p. 605-612, 2008.
Codogno, P.; Meijer, A. J.; Atg5: more than an autophagy factor; nature cell biology, v. 8, n. 10, October; 2006.
Deretic, V., et al; Autophagy in infection, inflammation and immunity; Nature Reviews, Immunology; v. 13; October, 2013.
59
Fortes, M.R.P., et al.; Imunologia da paracoccidioidomicose; An Bras Dermatol; v. 86, n. 3, p. 516-25, 2011.
Franco, M.; et al; Chlamydospore formation by Paracoccidioides
brasiliensis mycelial form. Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo, v. 31, n. 3, p. 151-
157, 1989.
Gegembauer G., et al.; Serology of Paracoccidioidomycosis Due to
Paracoccidioides lutzii. PLoS Negl Trop Dis; v. 8. Julho, 2014.
Geissmann, F. et al; Development of monocytes, macrophages and
dendritic cells; Science, NIH aublic access (author manuscript); v. 327; p.
656–661. February, 2010.
Hammond S. et al; An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional
gene silencing in Drosophila cells; Nature 404; v. 6775, p. 293–6, 2000.
Hippert, M.M. et al. Autophagy in cancer: good, bad, or both? Cancer Research. v. 66, n. 19, p. 9.349-51; 2006.
Jiménez-López, C.; Lorenz, M. C.; Fungal Immune Evasion in a Model Host–
Pathogen Interaction: Candida albicans Versus Macrophages. PLoS
Pathog v. 9, n. 11; November 21; 2013.
Klionsky, D. J.; The molecular machinery of autophagy: unanswered
questions. J. Cell Science; v. 118; p. 7-18; 2005.
Kurokawa, C.S. et al; Virulence profile of ten Paracoccidioides brasiliensis
isolates. Association with morphologic and genetic patterns. Rev. Inst. Med.
trop. S. Paulo, v. 47; n. 5; p. 257-262; 2005.
Lamb, C. A., et al. The autophagosome: origins unknown, biogenesis
complex; nature reviews molecular cell biology, v. 14, p. 759; December, 2013.
Levine, B.; Eating oneself and uninvited guests: autophagy-related pathways in cellular defense. Cell v. 120, p. 159–162; 2005.
Marques S. A., et al; Paracoccidioidomicose: frequência, morfologia e
patogênese de lesões tegumentares; An Bras Dermatol; v. 82; p. 411-417;
2007.
Mintern J. D. and Villadangos J. A.; Autophagy and mechanisms of effective
immunity. Frontiers in Immunology; Antigen Presenting Cell Biology; v. 3,
Article 60; April 2012.
Monteiro da Silva, J.L. et al.; Interação de Paracoccidioides brasiliensis com
células endoteliais; Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl., v. 26, n. 2, p. 149-156;
2005.
Mosser, D. M.; Edwards, J. P.; Exploring the full spectrum of macrophage
activation; Nat Rev Immunol; v. 8; n. 12; p. 958–969. December, 2008.
Netea, M.G. et al; An integrated model of the recognition of Candida
albicans by the innate immune system. Nat Rev Microbiol. v. 6, p. 67–78;
2008.
Nicola, A.M. et al; Macrophage autophagy in immunity to Cryptococcus
neoformans and Candida albicans. Infect Immun.; v. 80, n. 9, p. 3065-76.;
Sep 2012.
Palmeiro M, Cherubini K, Yurgel LS; Paracoccidioidomicose – revisão da literatura; Scientia Medica, Porto Alegre: PUCRS, v. 15, n.. 4, out./dez, 2005.
Pereira, V. B. R. et al; Molecular approaches for eco-epidemiological
studies of Paracoccidioides brasiliensis; Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de
Janeiro, v. 104; n. 4; p. 636-643; 2009.
Qin, Q. M. et al; Functional analysis of host factors that mediate the
intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathog.; v. 7; Jun,
2011.
S. Li, M. P. et al; Sterical hindrance promotes selectivity of the autophagy