Para uma melhor compreensão do desenvolvimento do CBC, estudos clínicos e moleculares envolvendo expressão gênica, sequenciamento gênico, análise de mutações, epigenética e silenciamento gênico vêm sendo realizados. Os resultados desses trabalhos têm alimentado banco de dados como NCBI (National Center for
Biotechnology Information), Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), entre
outros, e tem fornecido subsídios para a construção e o entendimento de vias de sinalização importantes, como a via de sinalização HH e Wnt. Para o CBC, já existe esquemas como mostrado na Figura 17, mostrando a participação de genes da via de sinalização HH e Wnt e de outras vias correlacionadas na formação do carcinoma basocelular.
Resumidamente, a interação entre SHH e PTCH1 ativa a via de sinalização HH liberando SMO. Uma vez liberado, este último, ativa uma cascata de reações aumentando os níveis de fatores de transcrição, por exemplo, os GLI. Dentro do núcleo, os GLI ativam ou reprimirem outros genes (como wnt, foxe1, hhip e bmp) levando a uma instabilidade genômica por alterar a expressão de outros genes que vão desencadear reações em vias gênicas, influenciando em processos fundamentais da célula. Dentre estes genes, integrantes da família Wnt se ligam ao Frizzled ativando a via de sinalização Wnt. O que acarretaria em um aumento da capacidade de invasão e proliferação tumoral. Outros genes, como o p53, são afetados pela instabilidade genômica causada no núcleo da célula, promovendo mudanças no ciclo celular e diminuição na apoptose (Figura 17).
Figura 17. Via gênica do carcinoma basocelular. Adaptado de < http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?map05217 >
Diante dos dados obtidos neste trabalho, um novo esquema foi proposto representando os genes diferencialmente expressos nas amostras dos pacientes com CBC (nodular e superficial) em relação ao paciente sem neoplasia (Figura 18). Para montar o mesmo, não só o valor-P, bem como a correlação e o número de cópias também foram considerados.
Figura 18. Esquema representando genes diferencialmente expressos em CBC subtipos nodular e superficial. Em roxo, genes reprimidos com valor-P significativo. Em vermelho, genes superexpressos com valor-P significativo. Em laranja, genes superexpressos sem valor-P significativo com diferença de expressão. Em verde, genes reprimidos sem valor-P significativo com diferença de expressão. Em preto, genes que apresentaram valores de expressão tanto superexpressos quanto reprimidos. Em branco, genes associado à via, sem valor de P-significativo e com regulação diferencial (número de cópias). As setas vermelhas indicam superexpressão do gene e as setas pretas indicam repressão do gene.
Dos 84 genes analisados, 37 estão relacionados à via de sinalização HH e são eles: bmp2, bmp4, bmp5, bmp6, bmp7, bmp8a, bmp8b, c18orf8, cep76, c6orf138, cdon, dhh, fgf9, fkbp8, gas1, gli1, gli2, gli3, gsk3b, hhip, ift52, ihh, lrp2, npc1, npc1l1, otx2, ptch1, ptch2, ptchd1, ptchd2, ptchd3, rab23, shh, smo, stk36, sufu e zic2. Como podem ser observados no esquema proposto, os morfogenes shh, ihh e dhh encontram-se reprimidos. Segundo a literatura já descrita, estes morfogenes quando presentes induzem de formas diferentes a transdução de sinal HH. Eles se ligam a membros da família patched (ptch1, ptch2, pchd1, ptchd2 e ptchd3) reprimindo a ligação entre patched e SMO. A liberação de SMO promove uma sinalização de reações, a qual ativa
Proliferação e invasão Proliferação Ciclo celular Progressão tumoral Apoptose
um complexo Stk36/Su(Fu)/Gli/microtúbulos no citoplasma gerando um sinal de ativação para os fatores de transcrição Gli. Além disso, Su(Fu) retém proteínas GLI no citoplasma especialmente quando está reprimido, como é o caso no esquema proposto.
Desta forma, a sinalização para SMO estaria sendo liberada e consequentemente ativada por meio de interações entre o LRP2, que se encontra superexpresso, com os patch1, patch2 e c6orf138 (patchd4) que se mostraram superexpressos. A liberação de SMO promove uma cascata de reações downstream que irá afetar as proteínas GLI, que estão superexpressas nos grupos analisados. Além disso, O´Driscoll et al. (2006) sugerem que o ptch1 por poder estar trafegando entre a membrana celular e vesículas endocíticas em resposta a um ligante ativo HH, logo não só a expressão de RNAm como também a expressão protéica podem ser necessários para exercer sua atividade supressora de tumor.
Uma vez ativada, as proteínas GLI são capazes de induzir uma sinalização da via HH antes não presente nas células. Isto culminará na indução de genes como o
foxe1 e nos genes relacionados na via de sinalização Wnt, ocasionando problemas nas
funções biológicas normais da célula, por exemplo, danos no ciclo celular, apoptose, proliferação celular atípica e invasão tumoral.
A via de sinalização Wnt é uma das vias de sinalização que também sofrem alterações importantes e auxiliam na progressão tumoral de CBC. Dos 84 genes analisados, 36 genes participam da via de sinalização Wnt, e são eles: brtc, csnk1a1,
csnl1a1l, csnk1d, csnk1e, csnk1g1, csnk1g2, ctnbb1, fbw11, prkaca, prkacb, prkacg, prkx, prky, sfrp1, siah1, wif1, wnt1, wnt10a, wnt10b, wnt1, wnt 16, wnt2, wnt2b, wnt3, wnt3a, wnt4, wnt5a, wnt5b, wnt6, wnt7a, wnt7b, wnt8a, wnt8b, wnt9a, wnt9b. Destes,
14 genes (P<0.05) apresentam-se reprimidos, o que estaria promovendo a proliferação celular e invasão tumoral.
Interessantemente, a superexpressão do gene wnt5a leva a uma desregulação na sinalização deste gene, facilitando a invasão de múltiplos tipos de tumores incluindo melanoma, câncer da mama, câncer gástrico, câncer de pâncreas, osteossarcoma, entre outros (O’Driscoll et al., 2006). O mesmo pode ser visto neste trabalho para o CBC nodular. Além disso, o wnt5a apresenta potencial em reprimir a sinalização canônica de outros genes wnt.
Vários outros genes como bmp 2, bmp 4, bmp 6, kctd11, hhat, cdon, gas1, sfrp1,
csnk1a1, prkaca, prkacb, prkx, prky, zic1, zic2 entre outros, demonstrados neste
trabalho como diferencialmente expressos, estariam ativando ou reprimindo importantes genes para o desenvolvimento do CBC. Por exemplo, as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), do inglês bone morphogenetic proteins, participam da progressão do melanoma promovendo invasão celular e migração. Além disso, os genes BMP são importantes fatores no desenvolvimento dos ossículos da esclera, que são pequenas placas ósseas localizadas no globo ocular de muitos vertebrados. Duench (2012) aponta que a inibição localizada de BMP pode causar redução na expressão de ihh nos arredores de um tecido demonstrando que os BMP interagem com a via de HH. Braig et al., (2010) reportam que a perda de expressão de um microRNA representa o ponto inicial para uma cascata de sinalização resultando na superexpressão de BMP4 em células de melanoma.
Quando analisado a expressão dos genes ptchd3, smo, rab23, ift52 e bmp5 em CBC nodulares e CBC superficiais, estes genes se apresentam superexpressos para o CBC nodular e reprimidos para o CBC superficial. Isto indica que a via de sinalização HH e Wnt estariam mais ativada em CBC nodular em relação ao CBC superficial.
A proteína RAB23, superexpressa em CBC nodular e reprimida em CBC superficial, como mostrada na figura, tem como função regular a importação para o núcleo de fatores de transcrição Gli, o que promove um aumento na expressão de Gli. Possivelmente, este fato corrobora para o aspecto clínico do CBC nodular, pois este apresenta o gene rab23 superexpresso, ao passo que no CBC superficial ele está reprimido. As proteínas GLI ativadas incidim na desregulação gênica, promovendo eventos biológicos como proliferação celular, modificações no ciclo celular, invasão celular e apoptose. Como clinicamente o CBC nodular apresenta uma capacidade de penetrabilidade maior no tecido em relação CBC superficial, a expressão aumentada deste gene sugere que a via de sinalização HH e Wnt estaria mais ativada neste subtipo. Isto influenciaria diretamente na escolha dos tratamentos para este tipo de tumor. Por exemplo, no caso de um tratamento alternativo à cirurgia, como a terapia fotodinâmca (TFD), esta técnica no CBC nodular não seria a mais indicada, pois o CBC nodular possui a capacidade de penetrar mais no tecido, o que pode resultar em recidivas do câncer. A exérese cirúrgica, como foi vista, geralmente é o tratamento
mais indicado. Contudo este tipo de tratamento pode resultar em deformações físicas graves, de cunho estético, dependendo da localização do tumor.
Levando em conta todas estas informações, selecionou-se 12 genes (bmp4,
wnt3, wnt4, wif1, csnk1a1l, ptchd2, smo, bmp5, otx2, ptch2, ptchd3, ift52) como
potenciais candidatos para identificação e diferenciação dos subtipos nodular e superficial de CBC. A partir de novos estudos com estes 12 genes, novas informações quanto às diferenças moleculares entre CBC nodular e CBC superficial esperam ser encontradas.
Desta forma, este trabalho contribui para o entendimento da via de sinalização HH e Wnt nos CBC e seus subtipos bem como abre especulações de mecanismos de sinalização alternativos. Um número significativo de genes diferencialmente expressos foi obtido, corroborando com outros trabalhos e indicando outros genes que não são bem descritos ainda para o CBC.
10. CONCLUSÕES
Como conclusão, a extração do RNA de boa qualidade em amostras de tecido epitelial com pesos inferiores a 0,03g foi padronizada após inúmeros testes com diferentes técnicas e kits. Para o protocolo padronizado foi utilizado o aparelho TissueLyser II (Retsch®, Qiagen) para maceração e o kit RNeasy Mini (Qiagen) para extração e purificação do RNA das amostras.
Da análise de 84 genes por PCR Array contidos na placa da via de sinalização Hedgehog Humana (Qiagen®), 36 genes (csnk1a1l, dhh, ihh, kctd1, ptchd2, wnt3a,
wnt7a, wnt9b, wnt8a, npc1, wnt3, ctnnb1, fgf9, mtss1, fgfr3, fkbp8, mapk1, prkaca, prkacg, shh, wif1, wnt10a, wnt10b, wnt16, wnt2b, wnt4, wnt5a, bmp4, bmp8a, c6orf138, csnk1e, gsk3b, prkacb, ptchd1, wnt1 e wnt5b) mostraram um perfil de expressão gênica
alterada quando comparados os três grupos (CBC nodular, CBC superficial e controle – pele sadia sem neoplasia), considerando para a análise estatística o valor-P <0,05, a correlação e o número de cópias.
Considerando a expressão gênica diferencial nos três grupos, temos: para as amostras de CBC nodular em relação ao CBC superficial, 8 genes (bmp5, hhip, otx2,
prky, ptch1, ptch2, wnt2, zic1) apresentaram-se superexpressos e 9 genes (csnk1a1l, dhh, ihh, ptchd2, wnt16, wnt3a, wnt7a, wnt8a, wnt9b) apresentaram-se reprimidos;
comparado às amostras de CBC nodular em relação ao controle sem neoplasia, 8 genes (foxe1, c6orf138, hhip, lrp2, otx2, prky, ptch1, ptch2) apresentaram-se superexpressos e 26 genes (bmp2, bmp4, cdon, csnk1a1l, dhh, erbb4, fgfr3, ihh,
kctd11, ptchd1, ptchd2, shh, wif1, wnt10a, wnt10b, wnt16, wnt2b, wnt3, wnt3a, wnt4, wnt7a, wnt8a, wnt9b, zic2) apresentaram-se reprimidos; e, comparado as amostras de
CBC superficial em relação ao controle sem neoplasia, 3 genes (foxe1, lrp2, ptch2) apresentaram-se superexpressos e 14 genes (bmp2, bmp4, bmp5, cdon, erbb4,
fgfr3,wif1, wnt10a, wnt16, wnt2, wnt2b, wnt3, wnt4, wnt7b) apresentaram-se reprimidos.
Considerando o valor-P <0,005, para o grupo CBC nodular em relação ao CBC superficial, 8 genes (csnk1a1l, dhh, ihh, kctd11, ptchd2, wnt3a, wnt7a, wnt9b) apresentaram diferença de expressão gênica. Esses genes estão relacionados com membros da família HH e genes que codificam proteínas associadas (no caso de dhh e
ihh), com receptores HH (no caso de ptchd2), com a via de sinalização de receptores
celular (no caso de wnt3a e wnt7a) e com reguladores para o desenvolvimento de organismos multicelular (dhh, kctd11, wnt3a, wnt7a e wnt9a). Provavelmente, a expressão diferencial destes genes, no CBC nodular, indica uma maior participação da via de sinalização HH e Wnt nos processos biológicos neste subtipo por ser mais agressivo, que envolvem a proliferação celular, vascularização tumoral, diferenciação celular seletiva, redução ou inibição dos mecanismos apoptóticos.
Uma representação gráfica localizando e inferindo uma provável regulação dos genes diferencialmente expressos em CBC foi proposta. Genes como o hhip, cujo produto protéico facilita a ligação com o SHH na superfície celular, estão envolvidos nas etapas de transdução de sinal a partir de smo até os fatores de transcrição de Gli. A partir destes resultados foi possível inferir que os genes que participam das vias de sinalização HH e Wnt potencialmente estão envolvidos no processo de tumorigênese do CBC e seus subtipos.
Foi selecionado 12 genes (bmp4, wnt3, wnt4, wif1, csnk1a1l, ptchd2, smo, bmp5,
otx2, ptch2, ptchd3, ift52) como potenciais candidatos para identificação e diferenciação
dos subtipos nodular e superficial de CBC. A partir de novos estudos com estes 12 genes, novas informações quanto às diferenças moleculares entre CBC nodular e CBC superficial esperam ser encontradas.
Os resultados obtidos apresentaram um perfil de expressão gênica que pode auxiliar na compreensão das diferenças clínicas observadas entre o CBC nodular e o superficial. Genes–chave da via de sinalização HH têm sido alvo de estudos genéticos e moleculares, como o shh, pthc, smo, gli, uma vez que esses genes estão associados a diversos processos biológicos. Um número maior de amostras serão analisados para confirmação do padrão da expressão diferencial dos genes identificados neste trabalho.