9.1.4.1. Genes da via de sinalização HH -SHH
Dentre os três morfogenes de HH, o shh é o membro mais amplamente expresso e é o homólogo mais bem caracterizado até hoje (Bale, 2002 & Laurendeau et al., 2010). O gene shh codifica uma proteína de 45 kDa que sofre uma clivagem autocatalítica, gerando um fragmento C-terminal de 25 kDa a qual contém a unidade auto-catalítica e um fragmento N-terminal de 20 kDa. Este, quando ativo, se liga covalentemente ao colesterol e ao palmitol. O papel dessas alterações lipídicas na sinalização de HH ainda é desconhecida (Bale, 2002 e Athar, Tang et al., 2006).
No presente estudo, o gene shh apresentou resultado significativo (valor-P <0,05) na diferença de expressão gênica quando comparado ao tecido normal. No CBC superficial, o valor da diferença da expressão do gene obtido foi de -3,74 e para o CBC nodular o valor obtido foi de -4,48. Este resultado, onde o shh está reprimido, difere dos obtidos por O’Driscoll et al. (2006) o qual cita não observar mudanças significativas nos níveis de expressão do gene shh quando comparou CBC nodular e superficial com tecido normal. Provavelmente isto pode ser explicado considerando o número amostral pequeno (n=3) e características fenotípicas como: tipo de pele, exposição solar, exposição laboral e histórico genético, apresentada pelos indivíduos utilizados nos dois trabalhos.
-PTCH
Os receptores de membrana para os morfogenes de HH melhores caracterizados da família patched, são os ptch1 e ptch2. O gene ptch1 está localizado na região cromossômica 9q22.3, possui 23 éxons e desenvolve um papel fundamental na formação embrionária e de supressão tumoral (Cardoso, 2010). A sequência patched de cDNA prevê uma glicoproteína constituída por 1500 aminoácidos, com 12 domínios abrangendo a membrana e dois grandes loops extracelulares que são necessários para a ligação com a proteína hedgehog (Bale, 2002).
Vários trabalhos como os de Gailani et al. (1996), Nilsson (2000), Bale et al. (2002), Martinez et al. (2006), O’Driscoll et al. (2006), Yu et al. (2008), Yang (2008), van der Pols et al. (2011) corroboram com resultados semelhantes aos obtidos neste estudo, onde os genes ptch1 e ptch2 apresentaram uma superexpressão (por exemplo, neste trabalho, no gene ptch2 observou uma diferença de 93,8 vezes mais expresso no CBC nodular quando comparado com o controle).
Muitas mutações nestes genes que levam a ativação constitutiva da via HH têm sido identificadas em CBC, incluindo mutações por perda funcional no ptch1, caracterizando um efeito recessivo devido à perda de função de dois alelos no gene supressor de tumor, e mutações por ganho funcional no smo, caracterizando um efeito dominante devido à alteração de apenas um alelo em oncogenes. Estas mutações resultam em superexpressão da via de sinalização HH e ativação de genes alvos
downstream que estão associados com o crescimento celular e diferenciação (Epstein,
2008).
Segundo Yang (2008), quase todos os CBC apresentaram uma alta atividade na via de sinalização HH e estudos em modelos animais corroboram com a noção de que a ativação da sinalização de HH é suficiente para dirigir a tumorigênese em camundongos com CBC e células similares a CBC.
O’Driscoll et al. (2006) identificaram 2.108 transcritos/variantes de genes significantemente superexpressos, e 1.813 genes significantemente reprimidos em CBC quando comparados com tecido normal. Uma diferença de expressão de 11 vezes no gene ptch1 e o aumento da expressão de gli2 de 7.39 vezes foi observado nestes CBC. Contudo, O’Driscoll et al. (2006) não obteve valor-P significativo para o gene
ptch1 e para o gli2. Estes dados corroboram com os dados obtidos neste trabalho,
onde o gene ptch1 apresentou uma diferença de expressão de 11,23 e 2,45 para o CBC nodular e CBC superficial respectivamente e não apresentou valor-P significativo. Na tentativa de compreender os dados descritos acima, uma correlação foi feita entre o gene c6orf138 e o gene ptch1. O gene c6orf138, pouco descrito na literatura, foi escolhido por estar superexpresso em CBC nodular e superficial nas amostras analisadas neste estudo e apresentou valor-P significativo de 0,038, além de ser um receptor de membrana como os genes patched. A correlação obtida foi de 0,86, o que indica uma correlação forte entre estes genes.
O gene ptch2 é também um receptor transmembrana e está localizado na região cromossômica 1p32. Tem como característica ser um gene supressor de tumor na via hedgehog. O gene ptch2 humano é fortemente similar ao gene ptch1, possui 57% de identidade com o ptch1. A diferença se encontra principalmente na região hidrofílica entre os domínios transmembranas 6 e 7 (National Center for Biotechnology
Information, 2012). Para o gene ptch2, foi observada uma diferença de expressão de
93,8 e 12,59 vezes no CBC nodular e CBC superficial, respectivamente, em relação ao tecido normal. No entanto, como o valor-P não foi significativo, o mesmo gene c6orf138 (considerado na correlação para ptch1) foi usado para a correlação por ser um gene receptor de membrana da família de patched. A correlação apresentou um valor de 0,91, o que indica uma correlação muito forte entre estes genes.
Zaphiropoulos et al., (1999) demonstrou que o RNAm do ptch2 é submetido a splicing alternativo e está superexpresso em CBC. Através da técnica de hibridização in
situ este grupo mostrou que existe uma alta expressão de transcritos de ptch2 em CBC
similarmente como observado para o ptch1, sugerindo uma regulação negativa em
ptch2 por ptch1. Nilsson et al. (2000) sugere que mutações nos genes patched são
causais no desenvolvimento tumoral e não simplesmente um marcador do efeito da radiação ultra-violeta. Estudos em modelos animais transgênicos também sugerem que mutações na via de sinalização HH contribuem significantemente para a formação de CBC (Nilsson et al., 2000).
Bonifas et al. (2001) estudou 27 amostras de CBC e os níveis de RNAm do
ptch2 se mostraram altos enquanto que em células de queratinócitos preconfluentes da
epiderme (HEK – preconfluent epidermal keratinocytes) se apresentaram com baixo nível. Entretanto na epiderme normal o nível de RNAm do ptch2 se manteve alto, ao contrário do nível de ptch1 que se mostrou baixo. Em células HaCaT, o RNAm de ptch2 apresentou baixo nível, contudo acima do encontrado em células HEK. Estudos em pacientes com Síndrome de Gorlin-Goltz demonstraram que o ptch2 apresenta alterações nos CBC múltiplos característicos desta Síndrome (Dicker, Siller et al., 2002). Lacour (2002) relata que mutações em smo e em ptch2 estão envolvidas no desenvolvimento de CBC.
-SMO
Já o gene smoothened (smo) codifica uma proteína de membrana com sete domínios abrangendo integralmente a membrana com homologia aos receptores acoplados da proteína G (GPCR) (Denef et al. 2000; Taipale et al. 2002). A liberação de SMO por PTCH, quando a via está ativada, resulta na ativação de mais proteínas GLI, que age na transcrição de outros genes (como exemplo o p53), envolvidos na progressão tumoral de CBC (Martinez, 2006). Neste trabalho, o gene smo não apresentou valor-P significativo e o valor de correlação indicou uma fraca correlação (0,35) entre gsk3b e smo.
-Gli
Tang et al., 2007 observou que uma superexpressão de gli1 ou gli2 leva a formação de tumores CBC na pele de murinos. Corroborando com esse trabalho, os genes gli se apresentaram superexpressos nos CBC analisados em relação ao grupo normal (os valores obtidos foram 1,10; 1,42; 1,16 respectivamente pra gli1, gli2 e gli3 em CBC superficial. Para o CBC nodular os valores obtidos foram 1,15; 1,36; 1,28 respectivamente), mas não apresentaram valor-P significativo. Devido ao valor-P não ter sido significativo, a correlação foi feita. Os valores obtidos da correlação foram dados como muito forte para o gli3 (0,92), e, para gli1 (0,76) e gli2 (0,76) foi indicada uma correlação forte.
-FOXE1
O gene foxe1 está localizado no cromossomo 9q22, é membro de uma família de proteínas que se liga ao DNA por meio de um domínio forkhead (NCBI, 2012). Durante o desenvolvimento embriológico, o foxe1 é expresso na tireóide, na bolsa de Rathke, nas estruturas da faringe e folículos do cabelo (Moreno, 2003). As proteínas
forkhead exibem uma considerável diversidade funcional e estão implicadas numa
variedade de processos biológicos que vão desde o desenvolvimento embrionário até a regulação do crescimento e proliferação celular em tecidos adultos (Kaufmann e Knochel, 1996; Carlsson e Mahlapuu, 2002). Notavelmente, a expressão de vários genes forkhead de mamíferos demonstram ser controlados pela via de sinalização Hh/Gli (Eichberger et al., 2004). Neste estudo, o resultado obtido para o gene foxe1 não apresentou valor-P significativo. A correlação foi então realizada e obteve-se um
valor de 0,92 indicando uma forte correlação com o gene c6orf138, lembrando que o gene c6orf138 é um receptor de membrana da família patched e é fundamental para o controle da via de sinalização HH. A diferença de expressão gênica obtida para o
foxe1 em CBC nodular foi de 13,18 enquanto que para CBC superficial foi de 5,27
quando comparados ao tecido normal. Esse dado corrobora para uma expressão deste gene em resposta a via de sinalização HH.
Confirmando este fato, Eichberger et al. (2004) descreveram que o foxe1 é um alvo gênico direto de gli2, pois quando há a superexpressão de gli2 em queratinócitos humanos, os níveis de RNAm de foxe1 estão aumentados. Através de hibridização in
situ, eles observaram que o foxe1 é expresso na bainha externa da raiz do folículo
piloso, onde gli2 de murino também se expressa. A expressão de foxe1 também foi encontrada nos queratinócitos basais da epiderme humana e em CBC. Os dados obtidos por Eichberger et al. (2004) apontam para um suposto papel de foxe1 na mediação da sinalização de HH na epiderme humana downstream de gli2, além do seu papel em controlar a mitose. Venza et al. (2009) investigou os variantes genéticos de
foxe1 em carcinomas epidermóides cutâneos, contudo nenhuma mutação somática foi
encontrada. Eles conseguiram associar polimorfismos da cadeia polialanina do foxe1 com o carcinoma epidermóide cutâneo. Os resultados obtidos por Venza et al. (2009) sugerem que exista outro gene supressor de tumor que influencie de maneira mais acentuada do que o foxe1 na carcinogênese da pele.
-HHIP
O gene hhip é um regulador da via de sinalização HH e em células de carcinoma escamoso do esôfago, tanto hhip quanto pdgfrα, smo e su(fu) apresentaram um perfil
de superexpressão quando comparados com tecidos normais (Shahi et al., 2011; Yang et al., 2011). Bonifas et al. (2001) utilizando qPCR descreveram para 5 amostras de CBC nodulares uma diferença de expressão gênica de 40 vezes maior para este gene do que em pele normal e de aproximadamente 300 vezes maior do que na epiderme normal ou em células HEK (preconfluent epidermal keratinocytes). Estes dados reforçam os descritos neste trabalho, onde o hhip apresentou 46,52 vezes maior em CBC nodular do que no tecido normal, contudo não apresentou um valor-P significativo. A correlação indicou uma correlação moderada (0,64) utilizando o c6orf138 como variante. Isto indica que este gene é importante componente na via HH e que apesar
de não apresentar valores estatísticos significativos neste estudo, ele não pode ser desconsiderado.
-LRP2
O gene lrp2, denominada em português por proteína 2 relacionada com lipoproteínas de baixa densidade (LDL), é comumente conhecida por megalina. A proteína codificada por este gene é um receptor multi-ligante endocítico que é expresso em diferentes tecidos, mas principalmente em tecidos como o rim (NCBI, 2012). A proteína lrp2 é crítica para a recaptação de numerosos ligantes, incluindo lipoproteínas, esteróides, proteínas vitaminas-ligantes e hormônios. Esta proteína possui papel na sinalização celular exercendo função como ligantes extracelulares que incluem hormônios da paratireóide e de SHH ou como ligantes do citosol que incluem proteínas da cascata MAP quinase e proteínas que interagem com JNK (NCBI, 2012). O gene
lrp2 está relacionado com os morfogenes HH e apesar de não ter apresentado valor-P
significativo, apresentou-se superexpresso nas amostras estudadas (4,57 para CBC superficial e 5,11 para CBC nodular), contudo sua correlação foi indicada como bem fraca (menor que 0,02) utilizando tanto o c6orf138 como o shh como variante.
-NPC1
O gene npc1, localizado na região 18q11-q12, codifica uma proteína presente na membrana dos endossomos e lisossomos. Este gene possui um papel regulador no tráfico de colesterol intracelular por meio da ligação do colesterol em seu domínio N- terminal. Apresenta 13 domínios transmembranas e 3 loops grandes no lúmen do endossomo. A proteína produzida por este gene transporta lipoproteínas de baixa densidade para compartimentos endossômicos/lisossomal onde são hidrolizados e liberados como colesterol livre. Defeitos neste gene causam a doença de Niemann-Pick tipo C (NPC), uma rara desordem neurodegenerativa autossômica recessiva caracterizada por excesso de acumulação de colesterol e glicoesfingolipídios no final de compartimentos endossômicas/lisossomal (NCBI, 2012). Ainda não foram relatados mutações ou defeitos neste gene associado ao câncer de pele não melanoma. Tang et al. (2010), relataram que mutações com perda funcional no gene npc1 levam a uma falha na fusão mediada por cálcio entre endossomos e lisossomos, resultando na acumulação de colesterol e outros lipídios em endossomos e lisossomos finais. Zambiere et al. (2009) observaram que concentrações nas espécies reativas de
oxigênio e peroxidação de lipídios foram maiores em fibroblasto de pacientes acometidos pela doença NPC do que em fibroblastos de amostras normais. Os fibroblastos dos doentes apresentaram maior susceptibilidade a apoptose depois de um estresse oxidativo agudo. Tanto os genes npc1 quanto npc2 são necessários para o bom funcionamento do tráfico lipídico intracelular, contudo o papel destas proteínas permanece desconhecido (Vance et al., 2011). Neste trabalho, estes genes encontram- se presente nos 3 grupos analisados com valor-P significativo.
-FKBP8
O gene fkbp8 codifica uma proteína, que é membro da família de proteínas imunofilina, o qual desempenha função na imunorregulação e nos processos celulares básicos envolvidos no empacotamento de proteínas. Possui um papel em neurônios associados com a função de memória (NCBI, 2012). Neste trabalho, este gene apresentou-se reprimido nos grupos analisados e com valor-P significativo.
- PTCHD1
Os genes fgf9, gsk3b, ptchd1 também se mostraram diferenciamente expressos com valor P < 0,05. O gene ptchd1 (do inglês Patched domain-containing protein 1) está localizado na membrana celular e é uma proteína de membrana com domínio em patched. Este gene age como receptor de morfogenes de sonic hedgehog. Este gene ainda não está associado com carcinoma basocelular. Neste trabalho, no CBC nodular, o gene ptchd1 está menos expresso e apresentou uma diferença de expressão de - 4,62 em relação ao grupo controle. No CBC superficial, este gene está menos expresso e apresentou uma diferença de expressão de -3,82.
9.1.4.2. Genes da via de sinalização WNT
Entre os membros WNT estudados contidos na placa de PCR Array da via de sinalização HH em estudo, os que apresentaram uma superexpressão em comparação com o tecido normal foram os membros wnt5a e wnt6 em CBC nodulares, e, wnt5a e
wnt11 em CBC superficiais. Todos os outros se apresentaram menos expressos.
Destaca-se entre os menos expressos os genes wnt2b, wnt3, wnt4, wnt8a, wnt9b,
-WNT5a
O gene wnt5a apresentou-se superexpresso nas amostras de CBC estudadas neste trabalho. O wnt5a é um ligante WNT não-canônico que não atua através de β- catenina. No desenvolvimento normal, wnt5a é segregado e dirige a migração de células alvo ao longo de gradientes de concentração. O efeito de wnt5a em células alvo é regulado por muitos fatores, incluindo o nível de expressão de inibidores e receptores. Tendo em vista o seu papel como regulador de migração celular para os tecidos adjacentes, a superexpressão devido à desregulação na sinalização de wnt5a facilita a invasão de múltiplos tipos de tumores incluindo melanoma, câncer da mama, câncer gástrico, câncer de pâncreas, osteossarcoma, entre outros (O’Driscoll et al., 2006). Contudo, a expressão e a distribuição de wnt5a no carcinoma de células escamosas cutâneo (CEC) e no CBC, bem como o efeito de wnt5a sobre a migração de queratinócitos não é descrita completamente. O perfil de expressão da via WNT mostrou que a regulação positiva de wnt5a em CEC é acoplado a repressão da sinalização canônica de WNT. Isto foi confirmado por imunohistoquímica mostrando a falta de acumulação de β-catenina, bem como ausência nuclear de Axin2. O’Driscoll et al. (2006) apresentaram resultados similares para o wnt5a (diferença de expressão igual a 3.35 vezes maior do que em tecido normal) e para o wnt6 (diferença de expressão igual a 4.86 vezes maior do que em tecido normal), corroborando com os resultados obtidos neste estudo.
-WNT2b
O gene wnt2b está envolvido no desenvolvimento humano, bem como na carcinogênese humana. Este gene apresenta duas variantes de transcrição por splicing alternativo (NCBI, 2012). Os genes wnt2, wnt4 e wnt7b podem estar associados com a proliferação anormal em tecido mamário. Mutações no gene wnt2b estão associadas à síndrome de Rokitansky-Kuster-Hauser e na síndrome de SERKAL (NCBI).
-WNT10 e WNT6
O gene wnt10a é fortemente expresso nas linhas de células de leucemia promielocítica e linfoma de Burkitt. Sabe-se que wnt10a e o wnt6 são fortemente co- expressos em linhas de células de câncer colorretal. Tanto o wnt10a e o wnt6 estão agrupados na região 2q35 cromossomo. Supõe-se que o wnt10b pode estar envolvido
no câncer da mama também. A sinalização da proteína codificada por este gene é um provável interruptor molecular que regula a adipogênese. O wnt10a é agrupado com outro membro da família, o wnt1, na região 12q13 do cromossomo (NCBI, 2012).
-WNT16
O gene wnt16 contém duas variantes de transcritos. Eles são expressos diferencialmente em tecidos normais, a variante 2 é expresso em níveis significativos apenas no pâncreas, enquanto que a variante 1 é expressa mais ubiquamente com níveis mais elevados em rim adulto, placenta, cérebro, coração e baço (NCBI, 2012). Segundo Teh et al. (2007), foi relatado que o gene wnt16b está superexpresso em CBC quando comparado com tecido normal, mas a sua isoforma wnt16a não está. Nesse experimento, observou-se que a expressão celular de wnt16b em queratinócitos primários não participa da estabilização da via β-catenina e também não ativa o fator potenciador linfóide ou o fator de transcrição repórter de células T. Wnt16b ativa a cascata quinase Jun-N-terminal, seguindo o modelo da via de sinalização não canônica de Wnt. Observou-se que a expressão constitutiva de wnt16b significativamente potencializa a taxa de proliferação celular e prolonga a clonogenicidade nos queratinócitos primários e a sua superexpressão induz um fenótipo de hiperproliferação em um sistema de cultura organotípico (Teh et al., 2007).
-WIF1
O gene wif1 codifica uma proteína que tem como função a de inibir proteínas Wnt. A proteína WIF1 contém um domínio do fator inibitório WNT (WIF - WNT inhibitory factor) e cinco domínios EGF-like e estaria envolvido na segmentação do mesoderma (NCBI, 2010). Ele funciona como um gene supressor de tumor e tem sido encontrado silenciado epigeneticamente em vários cânceres, por exemplo, em carcinomas da nasofaringe. Em câncer de pulmão já foi descrito que a hipermetilação do seu promotor silenciaria o wif1 (Lin, 2006). Em melanomas, trabalhos como o de Lin et al. (2007) demonstraram o efeito da expressão de wif1 na supressão do crescimento tumoral por meio da inibição da via WNT in vivo. No presente estudo, wif1 apresentou-se reprimido (em CBC nodular com diferença de expressão em -11,4 e no CBC superficial com o valor de -45,58), tendo o valor-P significativo. No entanto, não há relatos desse gene em câncer de pele não melanoma.
-CSNK1a1l
O gene csnk1a1l, também conhecido por caseína quinase 1, tipo alfa 1 ou CK1, é um receptor da via WNT, possui atividade quinase serina/treonina e regula vários processos celulares. Este gene é autoregulado por modificações pós-translacionais, incluindo autofosforilação (Cheong, Virshup, 2011). Contudo, pouco se sabe sobre a expressão e o papel funcional de csnk1a1l em células tumorais. Sinnberg et al, (2010) mostrou que a expressão de csnk1a1l em diferentes tipos de tumor ou é fortemente suprimido ou é completamente perdido durante a progressão tumoral. Em células metastáticas de melanoma, a reexpressão de csnk1a1l reduz o crescimento in vitro e a formação de metástase in vivo, além de induzir a apoptose e a parada do ciclo celular, considerando que a supressão de csnk1a1l em células primárias de melanoma induz o crescimento invasivo do tumor. Na comparação dos resultados de CBC nodular com o CBC superficial, este gene apresentou valor-P significativo e uma diferença de expressão de -9,87, valores os quais corroboram com os dados obtidos por Sinnberg et a. (2010).
-PRKA
Os genes prkaca, prkacb, prkacg também se mostraram diferenciamente expressos com valor P significativo. A proteína quinase A (do inglês, Protein Kinase A) (PKA) é uma quinase Ser/Thr depedente de AMP cíclico (cAMP) envolvida na regulação de múltiplos processos biológicos incluindo crescimento celular e divisão, diferenciação celular, bem como metabolismo e resposta imune. Dois genes codificam subunidades especificas (subunidade C) para a formação do PKA, e eles são o prkaca e prkacb. Além destes, prkx, prky e prkacg estão identificados como genes com subunidade C no PKA. Enquanto que nenhum produto protéico tem sido identificado para o prky e o prkacg, no prkx ocorre um processo de tradução para uma proteína quinase, a qual é inibida pela subunidade R pelo cAMP. Poucas doenças estão relacionadas com defeitos ou alterações nos genes que codificam subunidades de PKA