Desde o primeiro relato feito por Dutrochet em 1824 que os leucócitos aderiam à parede vascular e migravam para o tecido, as interações entre leucócitos e endotélio têm atraído interesse de muitos pesquisadores. Observa-se uma pequena interação fisiológica entre neutrófilos e a parede dos vasos, com cerca de um décimo do pool de neutrófilos atravessando o endotélio em direção ao ambiente extravascular (HARLAN, 1985). Estas interações fisiológicas de leucócitos circulantes e endotélio são alteradas durante reações inflamatórias agudas ou crônicas. Nestas condições, alterações reológicas e hemodinâmicas, caracterizadas por vasodilatação, exsudação de proteínas plasmáticas, com conseqüente redução da velocidade do fluxo sanguíneo, induzidas pela ação de mediadores químicos liberados por macrófagos residentes e mastócitos na fase inicial do processo (citocinas, quimiocinas, aminas vasoativas e eicosanóides), provocam a marginação das células brancas ao endotélio, predominantemente de vênulas pós-capilares próximas à área lesada. Em contato direto com o endotélio, os leucócitos inicialmente deslizam sobre a parede vascular (comportamento rolling). Com o progredir da reação, as células brancas aderem firmemente ao endotélio (aderência), para a subsequente migração por entre as junções interendoteliais (transmigração) e migração no tecido extravascular (HARLAN, 1985; HARLAN et al., 1991; MULLER, 2003; MEDZHITOV, 2008). Estes fenômenos, denominados, em
31 ___________________________________________________________________________ conjunto, de interação leucócito-endotélio, são as etapas iniciais e fundamentais para o recrutamento das células brancas em direção ao tecido lesado.
Embora as primeiras observações sobre a migração celular tenham sido feitas há mais de 180 anos, os mecanismos celulares e moleculares responsáveis pela interação leucócito-endotélio só passaram a ser mais bem elucidados a partir da década de 80, com a identificação das moléculas de adesão (GALLATIN et al.,1983; ALBELDA et al., 1994; CARLOS & HARLAN, 1994;DOERSCHUK, 1999). Tem sido proposto que ativação e/ou expressão de moléculas de adesão em cascata medeiam o rolling, a aderência e, subseqüentemente, a diapedese e migração de leucócitos no tecido extravascular (Figura 3).
A captura dos leucócitos a parede vascular não depende apenas dos receptores expressos nas membranas celulares, mas também de alterações reológicos da corrente sanguínea. O processo conhecido como marginação, orienta o fluxo de leucócitos sobre parede vascular. Primeiramente, ocorre vasoconstricção transitória e, então, vasodilatação provocada pela liberação de histamina pelos mastócitos, quando estimulados pelo agente lesivo. O aumento de permeabilidade leva ao edema. Com isso, aumenta a concentração de células vermelhas dentro do vaso, o que promove o aumento da viscosidade sanguínea. Como consequência, há lentificação da circulação (estase) e, depois, marginação leucocitária. As hemácias têm fluxo axial e os leucócitos, fluxo mais marginal. Com a estase, os leucócitos tendem ainda mais a fazer marginação leucocitária (GRANGER & KUBES, 1994).
Está bem estabelecido, para maioria dos leitos microcirculatórios, que o comportamento rolling é mediado pela expressão/ativação de moléculas pertencentes à famílid das selectinas. O comportamento rolling, está muito bem estabelecido ser mediado pelas moléculas pertencentes à família das selectinas. As selectinas incluem um grupo de três moléculas, L-, P- e E-selectina, denominadas de acordo com a célula aonde foram descritas pela primeira vez, ou seja, linfócito (L- selectina), plaqueta (P-selectina) ou célula endotelial (E-selectina). Elas apresentam em comum uma estrutura em mosaico constituída de um domínio extracelular N- terminal do tipo lectina, um domínio semelhante ao fator de crescimento epidermal (Epidermal Growth Factor, EGF), um número variável de domínios homólogos a proteínas regulatórias do fator complemento, um domínio transmembrana e um domínio C-terminal intracitoplasmático (BEVILACQUA, 1993; SPERANDIO, 2006; SMITH, 2008). Todas as selectinas ligam-se as formas sializadas e fucosiladas do
32 ___________________________________________________________________________ tetrassacarídeo sialil Lewis (sLeX) (FOXALL et al., 1992). Outro ligante das selectinas é a P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), uma mucina inicialmente definida específica para P-selectina, também funciona como ligante para a E- selectina e L- selectina (McEVER et al., 1997). Outros ligantes específicos para cada selectina estão sumarizados na Tabela 1 (Adaptada de VON ANDRIAN et al., 1995; PANÉS et al., 1999).
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Figura 3- Representação esquemática da cascata do recrutamento leucocitário. Após um estímulo inflamatório, macrófagos residentes liberam mediadores inflamatórios como TNF-α, os quais induzem a expressão rápida de P- selectina estocada nos corpos de Weibel Palade e induzem expressão de E-selectina sobre o endotélio, além da L- selectina no neutrófilo. A interação entre selectinas e seus ligantes inicia o rolamento de leucócitos. A presença de quimiocinas ligadas à célula endotelial ou solúveis promove a ativação de integrinas, e estas por ligarem-se a diferentes receptores, entre os quais as moléculas da superfamília das imunoglobulinas, medeiam a subseqüente aderência e transmigração. Exemplos de moléculas de adesão envolvidas em cada etapa estão demonstrados na figura.
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Tabela 1. Resumo das moléculas de adesão e seus ligantes envolvidos na interação leucócito-endotélio
Molécula de adesão Distribuição Ligantes Função
Selectinas
L-selectina E-selectina P-selectina
Todos os leucócitos exceto células T de memória e NKCs Células endoteliais
Plaquetas, células endoteliais
sLex, PNAd, MAdCAM-1, PSGL-1, E-
selectina e P-selectina sLex, PSGL-1, ESL-1 sLex, PSGL-1, PNAd Rolling Rolling Rolling Integrinas L 2 (LFA-1; CD11a/CD18) M 2 (Mac-1; CD11b/CD18) X 2 (p150,95; CD11c/CD18) D 2 (CD11d/CD18) 4 1 (VLA-4) 4 7 (LPAM-1) Todos os leucócitos
Granulócitos, monócitos, células T ativadas Células dendríticas
Monócitos, macrófagos e eosinófilos Maioria dos leucócitos
Linfócitos, NKCs, mastócitos, monócitos
ICAM-1, ICAM-2, JAM-A ICAM-1, fibrinogênio, C3b,JAM-C Fibrinogênio, C3b
ICAM-1, VCAM-1
VCAM-1, fibrinogênio, JAM-B MAdCAM-1, fibronectina, VCAM-1
Adesão, transmigração Adesão, transmigração Adesão Adesão Rolling, adesão Rolling, adesão Superfamília das Imunoglobulinas ICAM-1 ICAM-2 VCAM-1 MAdCAM-1 PECAM-1 JAM-A JAM-B JAM-C
Maioria dos tipos celulares Células endoteliaias e plaquetas Células endoteliais
HEVs em placas de Peyer e MLV Células endoteliais, plaquetas e leucócitos
Células endoteliais, células epiteliais, plaquetas e maioria dos leucócitos
Células endoteliais, HEVs
Células endoteliais, HEVs, plaquetas, monócitos
LFA-1, Mac-1, fibrinogênio LFA-1, Mac-1 VLA-4, 4 7 , D 2 4 7 , L-selectina PECAM-1 JAM-A JAM-B, JAM-C JAM-C, JAM-B Adesão, transmigração Adesão, transmigração Rolling, adesão Rolling Transmigração Transmigração Transmigração Transmigração Miscelânea
CD99 Células endoteliais, leucócitos CD99 Transmigração
VAP-1 Sinusóides hepáticos, endotélio, músculo liso,linfócitos Ácido siálico Rolling, adesão
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Os ligantes das selectinas pertencem ao grupo de glicoproteínas intimamente ligadas à glicosilação pós-translacionais. As enzimas envolvidas nessa glicosilação incluem as glicosiltransferases, fucosiltransferases e sulfotransferases, as quais têm como função transferir nucleotídeos ligados a açúcares, como GDP-fucose e UDP- galactose, para receptores glicoconjugados (SPERANDIO, 2006). Uma doença rara em humanos, conhecida como LAD II (Leukocyte Adhesion Deficiency), enfatiza a importância dessas modificações pós-translacional sobre a síntese dos ligantes para selectinas. Estes indivíduos apresentam transporte de guanosine diphosphate (GDP)-fucose ineficaz, resultando numa hipofucozilação de glicoproteínas, entre as quais os ligantes para as selectinas. Os pacientes exibem persistente leucocitose, defeito em rolling de leucócitos e, conseqüentemente, infecções bacterianas recorrentes (HELMUS et al., 2006).
A L-selectina foi identificada em camundongos, pelo seu envolvimento na recirculação de linfócitos em endotélio de vênulas dos linfonodos (GALLATIN et al.,1983). Ela está presente exclusivamente e constitutivamente na maioria dos leucócitos, com exceção de uma porção de células T de memória e natural killers, e é a principal molécula responsável pela interação inicial destas células com o endotélio (GRIFFIN et al., 1990; TEDDER et al.,1990; LUND-JOHANSEN et al.,1993). Na circulação de humanos saudáveis, cerca de 50% dos linfócitos, 40 a 80% dos monócitos, 95% dos polimorfonucleares e a maioria das células B expressam a L-selectina na sua membrana (BRUEHL et al., 1996; RAINER, 2002). Sua expressão é baixa no pool mitótico de células na medula, mas aumenta gradativamente no decorrer do processo de maturação (TEDDER et al., 1990; LUND-JOHANSEN & TERSTAPPEN, 1993; VAN EEDEN et al., 1997). Em granulócitos, a expressão de L-selectina no processo de maturação pode promover interações celulares que compartimentalizam estas células no tecido hematopoiético (DIMITROFF et al., 2001). No entanto, como salientado anteriormente, sua expressão parece não estar envolvida com migração dos neutrófilos da medula para o sangue (ROBINSON et al., 1999). A regulação da expressão de L-selectina varia entre os diferentes tipos de leucócitos e é influenciada por ação hormonal, ação das citocinas e fatores eletrolíticos ou estruturais (RAINER, 2002). Em resposta a uma variedade de estímulos como ésteres de forbol e fatores quimiotáticos, a L-selectina sofre clivagem da superfície dos leucócitos e este fenômeno altera a habilidade dessas células interagirem ao endotélio e migrarem para os tecidos inflamados
36 ___________________________________________________________________________ (JUTILA et al., 1989; KISHIMOTO et al., 1989; JUNG & DAILEY, 1990, SMALLEY & LEY, 2005). As proteases envolvidas e a importância desta clivagem em leucócitos ainda não estão completamente estabelecidas. Existe evidência que a TNF-alpha converting enzyme (TACE), também conhecida como ADAM-17, participa da clivagem da L-selectina em timócitos após estimulação com phorbol myristate acetate (PMA) (PESCHON et al., 1998). Alguns estudos indicam que o comportamento rolling induz a clivagem da molécula, e desta forma o leucócito pode retornar à circulação. No entanto, se um estímulo químico adequado está presente para a ativação das β integrinas, responsáveis pela aderência, a clivagem de L- selectina passa a ser fundamental para a transmigração (HAFEZI-MOGHADAM et al., 2001; RAINER, 2002; SMALLEY AND LEY, 2005).
A P-selectina é encontrada em plaquetas e estocada nos corpos de Weibel Palade na célula endotelial (McEVER et al., 1989). Quando a célula endotelial é ativada por fatores vasoativos, como histamina e trombina, a P-selectina é rapidamente mobilizada para a membrana externa da célula, permitindo a sua interação com leucócitos circulantes (GENG et al., 1990). A expressão na superfície celular é transiente e a molécula sofre reinternalização por endocitose para posterior expressão (SUBRAMANIAM et al., 1993; SMITH, 2008). Adicionalmente, a P- selectina pode ser regulada transcripcionalmente e sua expressão induzida por lipopolissacarídeo (LPS) ou citocinas como TNF-α e IL-1 (PAN et al., 1998; SMITH, 2008). Esta molécula também funciona como transdutora de sinais importantes para o rolling de leucócitos (APLIN et al., 1998).
A E-selectina é expressa unicamente após ativação celular, com exceção de microvasos da pele e medula óssea que possuem pequenas concentrações constitutivas desta molécula. Sua expressão na superfície celular depende de síntese protéica e é induzida na célula endotelial por citocinas como IL-1 ou TNF-α, sendo sua expressão máxima após 4hs de ativação, com redução de expressão a níveis basais após 24hs (BEVILACQUA et al., 1989; SMITH, 2008). Animais duplamente deficientes para P- e E-selectina apresentaram severas alterações no rolling de leucócitos com perda completa da interação leucócito-endotélio quando a microcirculação foi estimulada com TNF-α (BULLARD et al., 1996).
Uma vez que os leucócitos começaram a rolar, eles são capazes de responder ao ambiente extravascular. A redução da velocidade sobre a célula
37 ___________________________________________________________________________ endotelial permite que o leucócito detecte substâncias quimioatrativas, como leucotrieno B4, a fração 5a do sistema complemento ou quimiocinas. As quimiocinas
interagem com seus receptores expressos em leucócitos e acarretam a ativação das integrinas.
As integrinas são heterodímeros compostos de uma subunidade α e uma subunidade β. Cada subunidade tem um domínio extracelular amplo, um domínio único transmembrana e um citoplasmático curto contendo entre 20 e 70 resíduos. Em vertebrados são 18 subunidades α e 8 subunidades β. A associação dessas subunidades dá origem a 24 integrinas que foram agrupadas em subfamílias (LUO et al., 2007; SMITH, 2008). Estas proteínas receberam essa denominação por Hynes (1987) devido à habilidade de formar uma ligação entre a matriz extracelular e o citoesqueleto. A atividade das integrinas é regulada por um processo denominado inside-out signaling. Estímulos como as citocinas, quimiocinas e antígenos ativam vias que atuam sobre as porções citoplasmáticas das integrinas, alterando suas afinidades por ligantes ou influenciando sua disposição sobre a superfície celular, portanto, alterando sua atividade. Adicionalmente, a interação com seus ligantes enviam sinais dos domínios extracelulares para vias citoplasmáticas, processo chamado out-side signaling. Essa dinâmica das integrinas e mudanças conformacionais são necessárias para migração celular ocorrer de maneira eficiente (LUO et al., 2007; KINASHI, 2007). É bem estabelecido que a fosforilação da cadeia β é necessária para ativação destas moléculas (GAHMBERG et al., 1997).
As moléculas da subfamília β2 ou complexo CD18, composta de 4 moléculas-
CD11a/CD18 ou LFA-1 (lymphocyte function associated 1), CD11b/CD18 ou Mac-1 (macrophage antigen 1), CD11c/CD18 e CD11d/CD18, são as mais relevantes no recrutamento leucocitário e medeiam a aderência do leucócito ao endotélio e sua subseqüente diapedese (SMITH, 2008). Estudos in vivo, utilizando animais deficientes para CD18, demonstraram diminuição no percentual de células aderentes em vênulas pós-capilares inflamadas (SCHARFFETTER-KOCHANEK et al., 1998; FORLOW et al., 2000). A importância do complexo CD18 em humanos é bem demonstrada exemplificada em pacientes que possuem uma deficiência genética de β2 integrina, denominada deficiência de adesão leucocitária (LAD-I). Estes indivíduos
apresentam severas infecções recorrentes, lesões espontâneas na pela e expectativa de vida limitada (BUNTING et al., 2002). As β2 integrinas, como outras
38 ___________________________________________________________________________ moléculas que compõem as demais subfamílias das integrinas, são receptores importantes para a hematopoese. Neste contexto, tem sido demonstrado que além do papel de aderência ao microambiente hematopoiético (LICHTERFELD et al., 2000; LUNDAHL et al., 2002; CARION et al., 2002), as integrinas funcionam como sinalizadoras intracelulares para a maturação leucocitária (TAKEDA et al., 2003; SHI et al., 2004).
A ativação dos leucócitos coincide com a diminuição da velocidade do rolling e a transição para firme aderência. Este processo é estabelecido pela interação das integrinas com seus ligantes, moléculas pertencentes à superfamília das Imunoglobulinas, denominadas conhecidas como moléculas de adesão celular, intercelular (I)CAM-1, vascular (V)CAM-1, plaqueta-endotelial (PE)CAM-1 e moléculas de adesão juncional (GONZÁLEZ-AMARO & SÁNCHEZ-MADRID, 1999; HUMPHRIES et al., 2006). Estas proteínas possuem um domínio extracelular constituído por várias unidades repetidas homólogas a domínios de imunoglobulina G, uma região transmembrana e uma pequena cauda citoplasmática. São expressas em diferentes tipos celulares e as expressões de ICAM-1 e VCAM-1 no endotélio quiescente são baixas, mas na presença de estímulos inflamatórios suas concentrações na membrana endotelial são extremamente aumentadas (HUO & LEY, 2001). Diferentemente, as expressões constitutivas de ICAM-2 e PECAM-1 são significativas (HUO & LEY, 2001).
A transmigração é um processo no qual o leucócito atravessa a camada de células endoteliais, por vias transcelular ou paracelular, sendo que a paracelular parece ser a mais comum em processos inflamatórios (PETRI & BIXEL, 2006). Durante a transmigração paracelular, os leucócitos atravessam as junções endoteliais, as quais são ricas em proteínas de adesão transmembrana. A primeira proteína amplamente encontrada nestas junções, que interagem por ligações homofílicas e exercem função no processo de diapedese, foi a PECAM-1 (NEWMAN, 1997). A evidência da participação da PECAM-1 na transmigração de leucócitos foi demonstrada in vitro, utilizando anticorpos anti-PECAM-1, onde a transmigração de neutrófilos e monócitos foi reduzida (MULLER et al., 1993). Corroborando este efeito, animais knockouts para PECAM-1 apresentaram prejuízo na transmigração neutrofílica (SCHENKEL et al., 2006). Outras proteínas, que participam da transmigração de leucócitos, também foram identificadas nas junções
39 ___________________________________________________________________________ laterais célula-célula e denominadas junctional adhesion molecules (JAMs), vascular endhotelial (VE)-Caderina e CD99 (DEJANA, 2004).
Recentemente, outra molécula de adesão denominada vascular adhesion protein-1(VAP-1) foi caracterizada como uma molécula envolvida na mobilização leucocitária. Trata-se de uma monoamino-oxidase sensível a semicarbazida que catalisa a deaminação oxidativa de aminas primárias, formando o aldeído correspondente e liberando peróxido de hidrogênio e amônia. A VAP-1 está presente em vesículas citosólicas de células endoteliais e é translocada para a membrana celular após estímulo inflamatório. Esta molécula também é encontrada em células dendríticas, pericitos, células do músculo liso, adipócitos e linfócitos (SALMI & JALKANEN, 2001). O papel da VAP-1 no recrutamento leucocitário foi demonstrado pelo emprego de anticorpos monoclonais e animais geneticamente deficientes de VAP-1. In vivo, o tratamento de camundongos murinos com anticorpos anti-VAP-1 aumentou a velocidade do rolling e reduziu a aderência e a transmigração de granulócitos para o foco inflamatório (TOHKA et al., 2001). Em sistema de fluxo in vitro foi demonstrado que o bloqueio da VAP-1 prejudica os fenômenos de rolling e aderência de leucócitos em células endoteliais que expressavam a molécula (LALOR et al., 2002). Na inflamação hepática, a VAP-1 parece ser a principal molécula que medeia o recrutamento de linfócitos T CD4+ em vênulas pós-sinusóides e em sinusóides hepáticos de camundongos (BONDER et al., 2005). A participação enzimática da VAP-1 nos eventos de interação leucócito-endotélio também já foi explorada. Koskinen e colaboradores (2004) verificaram que a atividade enzimática da VAP-1 é um pré-requisito para a atividade adesiva de granulócitos ao endotélio, já que endotélio transfectado com VAP-1 enzimaticamente inativa inutilizada, mas estruturalmente íntegra apresentaram atividade adesiva menor. Adicionalmente, foi sugerido que a sinalização intracelular dependente da VAP-1 pode promover um estado de ativação diferenciado do endotélio vascular para uma resposta inflamatória amplificada. Estes autores demonstraram que a transcrição e translocação de P- e E-selectinas, bem como o rolling de linfócitos em células endoteliais foram dependentes da atividade enzimática da VAP-1 (JALKANEN et al., 2007). Em conjunto, os dados acima indicam que o bloqueio, tanto da atividade enzimática quanto da capacidade de interação ao receptor, ocasiona alterações nos fenômenos envolvidos no recrutamento leucocitário.
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